Alzheimer gaixotasunak (EA) ez ditu bere azpiko fisiopatologia anitz islatzen duten proteina biomarkatzailerik gabe, diagnostikoaren eta tratamenduaren aurrerapena oztopatzen dutenak. Hemen, proteomika integrala erabiltzen dugu AD fisiopatologiaren sorta zabala adierazten duten likido zerebrospinal (CSF) biomarkatzaileak identifikatzeko. Masa-espektrometria multiplexak 3.500 eta 12.000 proteina inguru identifikatu zituen AD CSFn eta garunean, hurrenez hurren. Garuneko proteomaren sareko analisiak 44 biodibertsitate-modulu ebatzi zituen, horietako 15 likido zefalorakizuloaren proteomarekin gainjarri ziren. Gainjarri diren modulu hauetan CSF AD markatzaileak bost proteina taldetan tolestuta daude, prozesu fisiopatofisiologiko desberdinak irudikatuz. AD garuneko sinapsiak eta metabolitoak gutxitzen dira, baina LCR-a handitzen da, eta garuneko eta LCR-ko glial-aberastutako mielinizazioa eta talde immuneak hazi egiten dira. Panelen aldaketen koherentzia eta gaixotasunaren espezifikotasuna 500 CSF lagin baino gehiagotan baieztatu ziren. Talde hauek AD asintomatikoaren azpitalde biologikoak ere identifikatu zituzten. Oro har, emaitza horiek urrats itxaropentsu bat dira ADn aplikazio klinikoetarako web-oinarritutako biomarkatzaile-tresnetarako.
Alzheimer gaixotasuna (AD) mundu osoan dementzia neuroendekapenezko kausa ohikoena da eta sistema biologikoen disfuntzio ugari ditu, besteak beste, transmisio sinaptikoa, glial bidezko immunitatea eta metabolismo mitokondriala (1-3). Hala ere, ezarritako proteina-biomarkatzaileak amiloidea eta tau proteina detektatzera bideratzen dira oraindik, eta, beraz, ezin dute islatu fisiopatologia anitz hori. Likido zerebroespinalean (CSF) fidagarrien neurtzen diren "nukleo" proteina-biomarkatzaile hauek honako hauek dira: (i) 1-42 amiloide beta peptidoa (Aβ1-42), plaka amiloide kortikalen eraketa islatzen duena; (ii) tau totala, axoien endekapenaren seinale; (iii) fosfo-tau (p-tau), tau hiperfosforilazio patologikoaren ordezkaria (4-7). Likido zerebroespinalaren biomarkatzaile hauek AD proteina-gaixotasun "markatuak" detektatzeko asko erraztu badute ere (4-7), gaixotasunaren atzean dagoen biologia konplexuaren zati txiki bat baino ez dute adierazten.
AD biomarkatzaileen aniztasun fisiopatologikorik ezak erronka asko ekarri ditu, besteak beste (i) AD gaixoen heterogeneotasun biologikoa identifikatu eta kuantifikatzeko ezintasuna, (ii) gaixotasunaren larritasuna eta progresioa nahikoa neurtzea, batez ere etapa preklinikoan, Eta (ii) iii) narriadura neurologikoaren alderdi guztiak guztiz konpondu ez dituzten sendagai terapeutikoen garapena. Erlazionatutako gaixotasunetatik AD deskribatzeko mugarri patologian dugun konfiantzak arazo hauek areagotzen ditu. Gero eta froga gehiagok erakusten dute dementzia duten adineko gehienek gainbehera kognitiboaren ezaugarri patologiko bat baino gehiago dutela (8). AD patologia duten pertsonen % 90 edo gehiagok gaixotasun baskularra, TDP-43 inklusioak edo beste gaixotasun endekapenezko batzuk ere baditu (9). Gainjartze patologikoaren proportzio handi hauek dementziaren egungo gure diagnostiko-esparrua eten egin dute, eta gaixotasunaren definizio fisiopatologiko zabalagoa behar da.
AD biomarkatzaile askoren premia premiazkoa dela ikusita, eremuak gero eta gehiago hartzen du biomarkatzaileak aurkitzeko sistema orokorrean oinarritutako "omika" metodoa. Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance 2014an jarri zen martxan eta programaren abangoardian dago. Osasun Institutu Nazionalak, akademiak eta industriak egindako diziplina anitzeko ahalegin honek sisteman oinarritutako estrategiak erabiltzea du helburu ADren fisiopatologia hobeto definitzeko eta biodibertsitatearen diagnostikorako analisi eta tratamendu estrategiak garatzeko (10). Proiektu honen baitan, sareko proteomika tresna itxaropentsu bihurtu da ADn sisteman oinarritutako biomarkatzaileen aurrerapenerako. Alborapenik gabeko datuetan oinarritutako ikuspegi honek proteomikako datu multzo konplexuak ko-adierazitako proteinen talde edo "moduluetan" antolatzen ditu, zelula mota, organulu eta funtzio biologiko espezifikoekin lotuta daudenak (11-13). Ia 12 informazio ugariko sare proteomika ikerketa egin dira AD garunean (13-23). Orokorrean, analisi hauek adierazten dute AD garun-sareko proteomak oso kontserbatutako antolakuntza modularra mantentzen duela kohorte independenteetan eta eskualde kortiko anitzetan. Horrez gain, modulu horietako batzuek ADri lotutako ugaritasunean aldaketa errepikagarriak erakusten dituzte datu multzoetan, gaixotasun anitzen fisiopatologia islatuz. Kolektiboki, aurkikuntza hauek garuneko sareko proteoma aurkikuntzarako aingura-puntu itxaropentsua erakusten dute AD-n sisteman oinarritutako biomarkatzaile gisa.
AD garun-sarearen proteoma klinikoki erabilgarriak diren sisteman oinarritutako biomarkatzaile bihurtzeko, garunetik eratorritako sarea AD CSFren analisi proteomikoarekin konbinatu genuen. Ikuspegi integratu honek CSF biomarkatzaileen bost multzo itxaropentsu identifikatzea ekarri zuen, garunean oinarritutako fisiopatologia ugarirekin lotuta daudenak, sinapsiak, odol-hodiak, mielinizazioa, hantura eta bide metabolikoen disfuntzioa barne. Biomarkatzaile-panel hauek arrakastaz balioztatu ditugu erreplikazio anitzen analisien bidez, hainbat gaixotasun neurodegeneratibotako 500 CSF lagin baino gehiago barne. Baliozkotze-analisi horien artean, AD asintomatikoa (AsymAD) duten pazienteen CSF-ko talde-helburuak aztertzea edo ingurune kognitibo normal batean amiloide metaketa anormalaren frogak erakusten dira. Azterketa hauek AsymAD populazioaren heterogeneotasun biologiko garrantzitsua nabarmentzen dute eta gaixotasunaren hasierako faseetan indibiduoak azpimota ditzaketen panel-markatzaileak identifikatzen dituzte. Orokorrean, emaitza hauek funtsezko urratsa dira proteina-biomarkatzaileen tresnak garatzeko sistema anitzetan oinarrituta, AD-ek dituen erronka kliniko asko arrakastaz ebatzi ditzaketen.
Ikerketa honen helburu nagusia ADra eragiten duten garunean oinarritutako hainbat fisiopatologia islatzen duten likido zerebroespinalaren biomarkatzaile berriak identifikatzea da. S1 irudiak gure ikerketa-metodologia zehazten du, zeinak (i) AD CSFren eta sareko garuneko proteomaren aurretiazko aurkikuntzek bultzatutako analisi integrala barne hartzen du, garunarekin erlazionatutako CSF gaixotasunaren biomarkatzaile anitz identifikatzeko, eta (ii) ondorengo erreplikazioa Biomarkatzaile hauek zerebroespinal independenteetan daude. kohorte fluidoak. Aurkikuntzara bideratutako ikerketa Emory Goizuetako Alzheimer Gaixotasunaren Ikerketa Zentroan (ADRC) kognitiboki normal diren 20 pertsona eta AD 20 gaixoren LCR-ren adierazpen diferentziala aztertzen hasi zen. ADren diagnostikoa narriadura kognitibo esanguratsu gisa definitzen da Aβ1-42 baxuaren presentzian eta tau eta p-tau totalaren maila altuetan likido zerebroespinalean [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA). )]] (S1A taula). Kontrolak (batez besteko MoCA, 26,7 ± 2,2) CSF biomarkatzaileen maila normalak zituen.
Giza LCR proteina ugaritasun tarte dinamikoa da, non albuminak eta oso ugariak diren beste proteinak interesgarri diren proteinak detektatzea eragotzi dezaketen (24). Proteinen aurkikuntzaren sakontasuna areagotzeko, CSF lagin bakoitzetik oso ugariak diren lehen 14 proteinak kendu genituen masa-espektrometria (MS) analisiaren aurretik (24). Guztira 39.805 peptido identifikatu zituen MS-k, eta 40 laginetan 3691 proteomekin mapatu ziren. Proteinen kuantifikazioa tandem masa etiketa anitzeko (TMT) etiketatze bidez egiten da (18, 25). Falta diren datuak ebazteko, laginen %50ean gutxienez kuantifikatu ziren proteinak bakarrik sartu ditugu ondorengo analisian, eta horrela, azkenean, 2875 proteoma kuantifikatu ditugu. Proteina ugaritasun-mailen guztizko diferentzia esanguratsua dela eta, kontrol-lagin bat estatistikoki kanpokotzat hartu zen (13) eta ez zen ondorengo analisian sartu. Gainerako 39 laginen ugaritasun-balioak adinaren, generoaren eta loteen kobariantzaren arabera egokitu ziren (13-15, 17, 18, 20, 26).
Erregresioko datu-multzoko adierazpen diferentziala ebaluatzeko t-test estatistikoaren analisia erabiliz, analisi honek kontroleko eta AD kasuen artean ugaritasun mailak nabarmen aldatu ziren proteinak identifikatu zituen (S2A taula). 1A irudian ikusten den bezala, AD-n guztira 225 proteina ugaritasuna nabarmen murriztu zen, eta 303 proteinen ugaritasuna nabarmen handitu zen. Diferentzialki adierazitako proteina hauek aldez aurretik identifikatutako ADren likido zefalorrakideoaren markatzaile batzuk barne hartzen dituzte, hala nola mikrotubuluekin lotutako proteina tau (MAPT; P = 3,52 × 10−8), neurofilamentua (NEFL; P = 6,56 × 10−3), hazkuntzarekin lotutako proteina 43. (GAP43; P = 1,46 × 10−5), Gantz-azido lotzeko proteina 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), kitinasa 3 bezalako 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), granulina neuronal (NRGN; P = 3,43 × 10−4) eta VGF nerbio-hazkunde-faktorea (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Hala ere, beste helburu garrantzitsu batzuk ere identifikatu ditugu, hala nola BPG disoziazioaren inhibitzailea 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) eta SPARC-ekin erlazionatutako kaltzio-lotura modularra 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). Gene Ontology (GO) 225 proteina nabarmen murriztutako analisiak gorputz-fluidoen prozesuekin lotura estuak agerian utzi zituen, hala nola, esteroideen metabolismoa, odol-koagulazioa eta hormonen jarduera (1B irudia eta S2B taula). Aitzitik, 303 proteina nabarmen handitu da zelula-egiturarekin eta energia-metabolismoarekin oso lotuta dago.
(A) Sumendiaren grafikoak log2 tolesturaren aldaketa (x-ardatza) erakusten du t-testak lortutako -log10 balio estatistikoaren (y-ardatza) eta kontrol (CT) eta adierazpen diferentziala detektatzeko erabiltzen dena. LKR proteomaren AD kasuak Proteina guztien artean. ADn maila nabarmen murriztua duten proteinak (P <0,05) urdinez ageri dira, eta gaixotasunaren maila nabarmen handitu duten proteinak gorriz. Hautatutako proteina etiketatuta dago. (B) Proteinarekin erlazionatutako GO termino nagusiak nabarmen murriztu (urdina) eta handitu (gorria) AD-n. Prozesu biologikoen, funtzio molekularren eta osagai zelularren alorretan z puntuazio altuena duten hiru GO terminoak erakusten ditu. (C) MS-k MAPT maila neurtu zuen CSF laginean (ezkerrean) eta bere korrelazioa ELISA laginaren tau mailarekin (eskuinean). Pearson-en korrelazio-koefizientea dagokion P balioarekin bistaratzen da. AD kasu baterako ELISA daturik ez dagoenez, zifra hauek aztertutako 39 kasuetatik 38ren balioak biltzen dituzte. (D) Kluster-analisi gainbegiratua (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) P <0,01 egokitua) kontrolean eta AD CSF-k datu multzoko 65 proteina esanguratsuenak erabiliz laginak aurkitu ditu. Normalizatu, normalizatu.
MAPTen maila proteomikoa oso lotuta dago modu independentean neurtutako ELISA tau mailarekin (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; 1C irudia), gure MS neurketaren baliozkotasuna onartzen duena. Amiloidearen proteina aitzindariaren (APP) mailan tripsina digestioaren ondoren, Aβ1-40 eta Aβ1-42ren C-muturrean mapatutako isoforma espezifikoko peptidoak ezin dira modu eraginkorrean ionizatu (27, 28). Horregatik, identifikatu ditugun APP peptidoek ez dute zerikusirik ELISA Aβ1-42 mailekin. Kasu bakoitzaren adierazpen diferentziala ebaluatzeko, P <0,0001 [false discovery rate (FDR) zuzendutako P <0,01] modu diferentzial batean adierazitako proteinak erabili ditugu laginen cluster analisi gainbegiratu bat egiteko (S2A taula). 1D irudian ikusten den bezala, 65 proteina oso esanguratsu hauek laginak behar bezala bil ditzakete gaixotasunaren egoeraren arabera, kontrol antzeko ezaugarriak dituen AD kasu bat izan ezik. 65 proteina horietatik 63k gora egin zuten ADn, eta bi bakarrik (CD74 eta ISLR) gutxitu ziren. Guztira, likido zerebroespinalaren analisi hauek gaixotasunen biomarkatzaile gisa balio dezaketen ADn ehunka proteina identifikatu dituzte.
Ondoren, AD garuneko proteomaren sareko analisi independente bat egin genuen. Aurkikuntza honen garuneko kohorteak kontroleko (n = 10), Parkinson gaixotasuna (PD; n = 10), AD/PD mistoa (n = 10) eta AD (n = 10) kasuak barne hartu zituen. ) Lagina. Emery Goizueta ADRC. 40 kasu horien demografia aldez aurretik deskribatu da (25) eta S1B taulan laburbiltzen da. TMT-MS erabili dugu 40 garuneko ehun hauek eta 27 kasuren erreplikazio-kohortea aztertzeko. Guztira, garuneko bi datu multzo hauek 227.121 peptido berezi ekoitzi zituzten, 12.943 proteomekin mapatu zirenak (25). Gutxienez kasuen %50ean kuantifikatu ziren proteinak bakarrik sartu ziren ondorengo ikerketetan. Azken aurkikuntzaren datu multzoak 8817 proteina kuantifikatu ditu. Doitu proteina ugaritasun mailak adinaren, generoaren eta post-mortem tartearen (PMI) arabera. Erregresioaren ondoren datu-multzoaren adierazpen diferentzialaren analisiak > 2000 proteina-mailak nabarmen aldatu zirela [P <0,05, bariantza-analisia (ANOVA)] bi gaixotasun-kohorte edo gehiagotan. Ondoren, kluster-analisi gainbegiratu bat egin dugu, desberdin adierazitako proteinen eta P <0,0001 AD/kontrol eta/edo AD/PD konparaketetan oinarrituta (S2, A eta B irudia, S2C taula). Oso alteratutako 165 proteina hauek AD patologia duten kasuak argi eta garbi irudikatzen dituzte kontrol eta PD laginetatik, proteoma osoan ADren espezifiko aldaketa indartsuak baieztatuz.
Ondoren, Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) izeneko algoritmoa erabili dugu aurkitutako garuneko proteomaren sare-analisia egiteko, zeinak datu multzoa antzeko adierazpen-ereduak dituzten proteina-moduluetan antolatzen baitu (11-13). Analisiak 44 modulu (M) batera adierazitako proteina identifikatu zituen, handienetik (M1, n = 1821 proteina) txikienera (M44, n = 34 proteina) ordenatuta eta zenbakituta (2A irudia eta S2D taula) . Goian esan bezala (13) Kalkulatu modulu bakoitzaren adierazpen-profil adierazgarria edo proteina bereizgarria, eta korrelazionatu gaixotasunaren egoera eta AD patologiarekin, hau da, Alzheimerren Gaixotasunaren Erregistroaren (CERAD) eta Braak Score-ren aliantza ezarri (2B Irudia). Oro har, 17 modulu AD neuropatologiarekin nabarmen erlazionatu ziren (P <0,05). Gaixotasunarekin lotutako modulu horietako asko zelula motako markatzaile espezifikoetan ere aberatsak dira (2B irudia). Goian esan bezala (13), zelula-mota aberastea moduluaren gainjartzea eta zelula-mota espezifikoen geneen erreferentzia-zerrenda aztertuz zehazten da. Gene hauek saguaren neurona isolatuetan, zelula endotelialetan eta glialetan argitaratutako datuetatik eratorritakoak dira. RNA sekuentziatzeko (RNA-seq) esperimentua (29).
(A) Ezagutu garuneko proteomaren WGCNA. (B) Biweight midkorrelation (BiCor) sinadura proteina modulararen (proteina modularren adierazpenaren lehen osagai nagusia) AD ezaugarri neuropatologikoekin (goian), CERAD (Aβ plaka) eta Braak (tau tangles) puntuazioak barne. Korrelazio positiboa (gorria) eta negatiboa (urdina) intentsitateak bi koloretako bero-mapa baten bidez erakusten dira, eta izartxoek esangura estatistikoa adierazten dute (P <0,05). Erabili Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (behean) proteina-modulu bakoitzaren zelula-motaren elkartea ebaluatzeko. Itzaldura gorriaren intentsitateak zelula motaren aberastasun maila adierazten du, eta izartxoak esangura estatistikoa (P <0,05). Erabili BH metodoa FETtik eratorritako P balioa zuzentzeko. (C) Proteina modularren GO analisia. Modulu bakoitzeko edo erlazionatutako modulu-talde bakoitzerako gehien erlazionatutako prozesu biologikoak erakusten dira. oligo, oligodendrozito.
Astrozito eta mikroglian aberatsak diren bost modulu multzo batek (M30, M29, M18, M24 eta M5) korrelazio positibo handia erakutsi zuen AD neuropatologiarekin (2B irudia). Ontologia analisiak modulu glial hauek zelulen hazkundearekin, ugalketarekin eta immunitatearekin lotzen ditu (2C irudia eta S2E taula). Bi modulu glial gehigarri, M8 eta M22, ere oso erregulatuta daude gaixotasunetan. M8 Toll-like hartzailearen bidearekin oso lotuta dago, berezko erantzun immunean funtsezko zeregina betetzen duen seinaleztapen-jauziarekin (30). Aldi berean, M22 oso lotuta dago itzulpen-ondoko aldaketarekin. M2, oligodendrozitoetan aberatsa dena, korrelazio positibo handia erakusten du AD patologiarekin eta lotura ontologikoa nukleosidoen sintesiarekin eta DNAren erreplikazioarekin, gaixotasunetan zelulen ugalketa areagotua adierazten duena. Orokorrean, aurkikuntza hauek AD sareko proteoman aurrez ikusi ditugun modulu glialen gorakada onartzen dute (13, 17). Gaur egun, sareko ADrekin erlazionatutako glial modulu askok adierazpen maila baxuagoak erakusten dituzte kontrol eta PD kasuetan, AD-n gora egiten duten gaixotasunaren espezifikotasuna nabarmenduz (S2C irudia).
Gure sareko proteomaren lau modulu (M1, M3, M10 eta M32) soilik negatiboki erlazionatuta daude AD patologiarekin (P <0,05) (2, B eta C irudia). M1 zein M3 markatzaile neuronaletan aberatsak dira. M1 seinale sinaptikoekin oso lotuta dago, eta M3 funtzio mitokondrialarekin oso lotuta dago. Ez dago M10 eta M32 zelula mota aberastearen frogarik. M32-k M3 eta zelulen metabolismoaren arteko lotura islatzen du, eta M10, berriz, zelulen hazkundearekin eta mikrotubuluen funtzioarekin oso lotuta dago. AD-rekin alderatuta, lau moduluek kontrola eta PD areagotu egiten dira, gaixotasunaren AD aldaketak emanez (S2C irudia). Orokorrean, emaitza hauek AD-n aurrez ikusi dugun neurona aberatsak diren moduluen ugaritasuna murriztea onartzen dute (13, 17). Laburbilduz, aurkitu genuen garuneko proteomaren sareko analisiak AD-bereziki aldatutako moduluak sortu zituen gure aurreko aurkikuntzekin bat.
AD etapa asintomatiko goiztiarra da (AsymAD), zeinetan gizabanakoek amiloide metaketa erakusten dute gainbehera kognitibo klinikorik gabe (5, 31). Etapa asintomatiko honek leiho kritikoa adierazten du detekzio goiztiarra eta esku hartzeko. Aurretik, AsymAD eta AD garuneko sareko proteomaren kontserbazio modular sendoa frogatu dugu datu multzo independenteetan (13, 17). Gaur egun aurkitu dugun garun-sarea aurreko aurkikuntza hauekin koherentea dela ziurtatzeko, 27 DLPFC erakunderen erreplikatutako datu multzoan 44 moduluren kontserbazioa aztertu dugu. Erakunde hauek kontrola (n = 10), AsymAD (n = 8) eta AD (n = 9) kasuak barne hartzen dituzte. Kontrol eta AD laginak gure aurkikuntzako garun-kohortearen analisian sartu ziren (S1B taula), AsymAD kasuak, berriz, erreplikazio-kohortean bakarrik izan ziren. AsymAD kasu hauek Emory Goizuetako ADRC garun bankutik ere etorri ziren. Heriotzaren unean kognizioa normala zen arren, amiloide-mailak anormalki altuak ziren (batez besteko CERAD, 2,8 ± 0,5) (S1B taula).
27 garun-ehun hauen TMT-MS azterketak 11.244 proteoma kuantifikatu zituen. Azken zenbaketa honek laginen gutxienez %50ean kuantifikatutako proteinak bakarrik hartzen ditu barne. Erreplikatutako datu-multzo honek gure aurkikuntzako garunaren analisian detektatu diren 8817 proteinetatik 8638 (% 98,0) ditu, eta ia 3000 proteina nabarmen aldatu ditu kontrol eta AD kohorteen artean (P <0,05, Tukey-ren t test parekatuaren ondoren bariantza aztertzeko) ( S2F taula). Diferentzialki adierazitako proteina horien artean, 910-k AD eta garuneko proteomaren kontrol kasuen arteko maila-aldaketa esanguratsuak ere erakutsi zituen (P <0,05, ANOVA Tukey parekatuko t-testaren ondoren). Aipatzekoa da 910 markatzaile hauek oso koherenteak direla proteomen arteko aldaketaren norabidean (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (S3A irudia). Gehitu diren proteinen artean, datu multzoen artean aldaketarik koherenteenak dituzten proteinak glial-aberastutako M5 eta M18 moduluetako kideak dira batez ere (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 eta GFAP). Murriztutako proteinen artean, aldaketa koherenteenak zituztenak ia esklusiboki sinapsiarekin lotutako M1 moduluko kideak ziren (NPTX2, VGF eta RPH3A). Gainera, midkine (MDK), CD44, frizzled-relazionatutako proteina 1 (SFRP1) eta VGF jariatzen dituzten ADrekin erlazionatutako aldaketak egiaztatu ditugu western blotting bidez (S3B irudia). Moduluak kontserbatzeko analisiak erakutsi zuen garuneko proteomaren proteina-moduluen % 80 inguru (34/44) nabarmen kontserbatu zirela erreplikazio-datu multzoan (z-score> 1.96, FDR zuzendutako P <0.05) (S3C irudia). Modulu horietako hamalau bi proteomen artean bereziki gorde ziren (z-score> 10, FDR zuzendutako P <1.0 × 10-23). Orokorrean, garuneko proteomaren arteko adierazpen diferentzialaren eta konposizio modulararen koherentzia-maila handia aurkitzeak eta erreplikatzeak AD cortex frontaleko proteinen aldaketen erreproduzigarritasuna nabarmentzen du. Horrez gain, AsymAD eta gaixotasun aurreratuagoek garun-sare-egitura oso antzekoa dutela baieztatu du.
Garunaren erreplikazioko datu-multzoko adierazpen diferentzialaren azterketa zehatzago batek AsymAD proteina-aldaketen maila esanguratsua nabarmentzen du, guztira 151 proteina nabarmen aldatu dira AsymAD eta kontrolaren artean (P <0,05) (S3D irudia). Amiloidearen kargarekin bat etorriz, AsymAD eta ADren garuneko APP nabarmen handitu zen. MAPT nabarmen aldatzen da ADn, hau da, korapilatze-maila handituarekin eta gainbehera kognitiboarekin duen korrelazio ezaguna (5, 7). Glialetan aberatsak diren moduluak (M5 eta M18) asko islatzen dira AsymAD-en proteina handituetan, eta neuronei lotutako M1 modulua AsymAD-en gutxitutako proteinen adierazgarriena da. AsymAD markatzaile horietako askok gaixotasun sintomatikoetan aldaketa handiagoak erakusten dituzte. Markatzaile horien artean dago SMOC1, M18-ri dagokion proteina gliala, garuneko tumoreekin eta begien eta gorputz-adarraren garapenarekin lotzen dena (32). MDK zelulen hazkundearekin eta angiogenesiarekin erlazionatutako heparinarekin lotzen duen hazkuntza-faktore bat da (33), M18-ko beste kide bat. Kontrol-taldearekin alderatuta, AsymAD nabarmen handitu zen, eta ondoren AD-en igoera handiagoa izan zen. Aitzitik, proteina sinaptikoa neuropentraxin 2 (NPTX2) nabarmen murriztu zen AsymAD garunean. NPTX2 lehenago neurodegenerazioarekin lotuta zegoen eta sinapsi kitzikatzaileen bitartekaritzan aitortutako rola du (34). Orokorrean, emaitza hauek gaixotasunaren larritasunarekin aurrera egiten dutela dirudien ADn proteina preklinikoen aldaketa desberdinak erakusten dituzte.
Garuneko proteomaren aurkikuntzan proteina-estalduraren sakontasun handia lortu dugula kontuan hartuta, sare-mailako AD transkriptomarekin duen gainjartzea hobeto ulertzen saiatzen ari gara. Hori dela eta, aurkitu genuen garuneko proteoma AD (n = 308) eta kontroleko (n = 157) DLPFC ehunetan 18.204 geneen mikroarray neurketatik aurrez sortutako moduluarekin alderatu dugu (13). gainjarriz. Guztira, 20 RNA modulu ezberdin identifikatu genituen, eta horietako askok zelula mota espezifikoen aberastea frogatu zuten, neuronak, oligodendrozitoak, astrozitoak eta mikroglia barne (3A irudia). AD-n modulu hauen aldaketa anitz 3B irudian ageri dira. Gure aurreko proteina-RNA gainjartzearen analisiarekin bat etorriz, etiketarik gabeko MS proteoma sakonagoarekin (3000 proteina inguru) (13), aurkitu ditugun garuneko proteoma sareko 44 modulu gehienak transkriptoma sarean daude. Ez dago gainjartze esanguratsurik ere. garuneko proteoman oso atxikita dauden 34 proteina-moduluen aurkikuntzak eta erreplikak, 14k (~% 40) bakarrik gainditu zuten Fisher-en proba zehatza (FET) transkriptomarekin estatistikoki esanguratsua zela gainjarri (3A irudia). DNAren kalteen konponketarekin (P-M25 eta P-M19), proteina-itzulpenarekin (P-M7 eta P-M20), RNA-ren lotura/splicing (P-M16 eta P-M21) eta proteina bideratzearekin (P-M13 eta P-) bateragarria. M23) ez da transkriptomoko moduluekin gainjartzen. Hori dela eta, gaur egungo gainjartze-analisian proteomaren datu-multzo sakonagoa erabiltzen den arren (13), AD sareko proteoma gehiena ez da transkriptoma sarearekin mapatzen.
(A) FET hipergeometrikoak AD transkriptomoaren RNA moduluan (goian) zelula motako markatzaile espezifikoak aberastea eta AD garuneko RNA (x ardatza) eta proteina (y ardatza) moduluen arteko gainjartze-maila erakusten du. (behean). Itzaldura gorriaren intentsitateak goiko paneleko zelula-moten aberaste-maila eta beheko paneleko moduluen gainjartzearen intentsitatea adierazten du. Asteriskoek esangura estatistikoa adierazten dute (P <0,05). (B) Transcriptoma modulu bakoitzaren gene ezaugarrien eta AD egoeraren arteko korrelazio-maila. Ezkerreko moduluak ADrekin erlazio negatiboena (urdina), eta eskuinekoa ADrekin erlazio positiboena (gorria). Log-eraldatutako BH zuzendutako P balioak korrelazio bakoitzaren esanahi estatistiko-maila adierazten du. (C) Gainjarritako modulu esanguratsuak zelula-mota partekatua aberasteko. (D) Etiketatutako proteinaren (x ardatza) eta RNA (y ardatza) log2 tolesturako aldaketaren korrelazio-analisia gainjarritako moduluan. Pearson-en korrelazio-koefizientea dagokion P balioarekin bistaratzen da. Mikro, mikroglia; zeruko gorputzak, astrozitoak. CT, kontrola.
Gainjarritako proteina eta RNA modulu gehienek zelula-mota aberasteko profil antzekoak eta AD aldatzeko norabide koherenteak partekatzen dituzte (3, B eta C irudia). Beste era batera esanda, garuneko proteomaren (PM1) sinapsiarekin erlazionatutako M1 modulua ARN homologoko hiru modulu neuronaletan (R-M1, R-M9 eta R-M16) mapatzen da, AD-n dauden biek erakutsi zuten. maila murriztua. Era berean, glialetan aberatsak diren M5 eta M18 proteina moduluak astrozitoetan eta markatzaile mikroglialetan (R-M3, R-M7 eta R-M10) aberatsak diren RNA moduluekin gainjartzen dira eta gaixotasunetan oso parte hartzen dute. Bi datu multzoen artean partekatutako ezaugarri modular hauek garuneko proteoman ikusi ditugun zelula-moten aberasteari eta gaixotasunei lotutako aldaketak onartzen dituzte. Hala ere, desberdintasun esanguratsu asko ikusi ditugu markatzaile indibidualen ARN eta proteina mailen artean partekatutako modulu hauetan. Gainjarritako modulu horien barruan dauden molekulen proteomikaren eta transkriptomikaren adierazpen diferentzialaren korrelazio-analisiak (3D irudia) inkoherentzia hori nabarmentzen du. Esaterako, APP eta beste hainbat glial modulu proteinak (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 eta SFRP1) AD proteomaren igoera nabarmena erakutsi zuten, baina AD transkriptoman ia ez zen aldaketarik izan. Proteina-aldaketa espezifiko hauek amiloide-plakekin estuki erlazionatuta egon daitezke (23, 35), proteoma aldaketa patologikoen iturri gisa nabarmenduz, eta baliteke aldaketa horiek transkriptoman ez islatzea.
Aurkitu ditugun garuna eta CSF proteomak modu independentean aztertu ondoren, bi datu multzoen analisi integrala egin dugu garun-sarearen fisiopatologiarekin lotutako AD CSF biomarkatzaileak identifikatzeko. Lehenik eta behin, bi proteomen gainjartzea definitu behar dugu. CSF-k AD garunean aldaketa neurokimikoak islatzen dituela oso onartua dagoen arren (4), AD garunaren eta CSF proteomaren arteko gainjartze-maila zehatza ez dago argi. Gure bi proteometan atzemandako gene-produktu partekatuen kopurua alderatuz, likido zefalorakideoan identifikatutako proteinen ia % 70 (n = 1936) garunean ere kuantifikatu zirela ikusi genuen (4A irudia). Gainjarritako proteina horietako gehienak (n = 1721) aurkikuntzako garuneko datu multzoko 44 espresio-moduluetako batean mapatzen dira (4B irudia). Espero bezala, sei garun-modulu handienek (M1etik M6ra) erakutsi zuten CSF gainjartze kopuru handiena. Hala ere, badaude garun-modulu txikiagoak (adibidez, M15 eta M29) gainjartze-maila ustekabeko altua lortzen dutenak, garun-modulu batek bere tamainaren bikoitza baino handiagoak. Horrek motibatu egiten gaitu estatistikoki zuzendutako metodo zehatzago bat hartzera, garunaren eta likido zerebroespinalaren arteko gainjartzea kalkulatzeko.
(A eta B) Aurkikuntzako garunean eta CSF datu multzoetan detektatu diren proteinak gainjartzen dira. Gainjarritako proteina horietako gehienak garuneko espresio-sareko 44 ko-espresio-moduluetako batekin lotuta daude. (C) Jakitu zerebrospinal fluidoaren proteomaren eta garun-sarearen proteomaren arteko gainjartzea. Bero-maparen errenkada bakoitzak FET hipergeometrikoaren gainjartze-analisi bereizia adierazten du. Goiko errenkadak garun-moduluaren eta CSF proteoma osoaren arteko gainjartzea (grisa/beltza) irudikatzen du. Bigarren lerroak garuneko moduluen eta CSF proteinaren arteko gainjartzea (gorriz itzalduta) nabarmen erregulatuta dagoela ADn (P <0,05) adierazten du. Hirugarren errenkadak erakusten du garun-moduluen eta CSF proteinaren arteko gainjartzea (itzal urdina) AD-n (P <0,05) nabarmen gutxituta dagoela. Erabili BH metodoa FETtik eratorritako P balioa zuzentzeko. (D) Modulu tolesgarriaren panela zelula-mota elkartean eta erlazionatutako GO terminoetan oinarrituta. Panel hauek burmuinarekin lotutako 271 proteina dituzte guztira, eta CSF proteoman adierazpen diferentzial esanguratsua dute.
Isats bakarreko FETak erabiliz, CSF proteomaren eta garun-modulu indibidualaren arteko proteina gainjartzearen garrantzia baloratu dugu. Analisiak agerian utzi zuen CSF datu multzoko 14 garun-moduluk estatistikoki esanguratsuak diren gainjartzeak (FDR doitutako P <0,05) eta modulu gehigarri bat (M18) zeinaren gainjartzea esanguratik gertu dagoen (FDR doitutako P = 0,06) (4C irudia). , goiko ilara). Diferentzialki adierazitako CSF proteinekin oso gainjarri diren moduluak ere interesatzen zaizkigu. Hori dela eta, bi FET analisi gehigarri aplikatu genituen zehazteko (i) CSF proteina zein den nabarmen handitu zen AD-n eta (ii) CSF proteina nabarmen murriztu zen AD-n (P <0.05, parekatuta t test AD/kontrola) Garuneko moduluak gainjarri esanguratsuekin. haien artean. 4C irudiko erdiko eta beheko errenkadetan erakusten den bezala, analisi gehigarri hauek erakusten dute 44 garun-moduluetatik 8 AD CSF-n gehitutako proteinarekin nabarmen gainjartzen direla (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 eta M38) . ), bi moduluek bakarrik (M6 eta M15) AD CSFn proteina murriztuarekin gainjartze esanguratsua erakutsi zuten. Espero zen bezala, 10 modulu guztiak CSF proteomarekin gainjartze handiena duten 15 moduluetan daude. Horregatik, 15 modulu hauek AD garunetik eratorritako CSF biomarkatzaileen etekin handiko iturriak direla suposatzen dugu.
Gainjarritako 15 modulu hauek bost proteina-panel handitan tolestu genituen WGCNA zuhaitz diagraman duten hurbiltasuna eta zelula-motekin eta gene-ontologiarekin duten loturaren arabera (4D irudia). Lehenengo panelak neurona-markatzaile eta sinapsiekin lotutako proteinetan (M1 eta M12) aberatsak diren moduluak ditu. Panel sinaptikoak 94 proteina ditu guztira, eta CSF proteomaren mailak nabarmen aldatu dira, bost panelen artean garunarekin erlazionatutako CSF markatzaileen iturri handiena bihurtuz. Bigarren taldeak (M6 eta M15) zelula endotelioko markatzaileekin eta gorputz baskularrekin lotura estua erakutsi zuen, hala nola "zaurien sendatzea" (M6) eta "erantzun immune humoralaren erregulazioa" (M15). M15 lipoproteinen metabolismoarekin ere oso lotuta dago, endotelioarekin oso lotuta dagoena (36). Panel baskularrak burmuinarekin lotutako 34 LCR markatzaile ditu. Hirugarren taldean oligodendrozitoen markatzaileekin eta zelulen ugalketarekin nabarmen erlazionatuta dauden moduluak (M2 eta M4) daude. Esaterako, M2-ren goi-mailako ontologia terminoek "DNAren erreplikazioaren erregulazio positiboa" eta "purinen biosintesi prozesua" barne hartzen dituzte. Bien bitartean, M4-renak "zelula glialen bereizketa" eta "kromosomaren bereizketa" barne hartzen ditu. Mielinizazio panelak burmuinarekin lotutako 49 CSF markatzaile ditu.
Laugarren taldeak modulu gehien ditu (M30, M29, M18, M24 eta M5), eta ia modulu guztiak nabarmen aberatsak dira mikroglia eta astrozito markatzaileetan. Mielinizazio panelaren antzera, laugarren panelak ere zelulen ugalketarekin lotura estua duten moduluak (M30, M29 eta M18) ditu. Talde honetako gainerako moduluak oso erlazionatuta daude termino immunologikoekin, hala nola "efektu immunearen prozesua" (M5) eta "erantzun immunologikoaren erregulazioa" (M24). Glial immunitate-taldeak garunarekin erlazionatutako 42 CSF markatzaile ditu. Azkenik, azken panelak lau moduluetan (M44, M3, M33 eta M38) garunarekin lotutako 52 marka biltzen ditu, guztiak energia biltegiratze eta metabolismoarekin lotutako gorputzean. Modulu hauetatik handiena (M3) mitokondrioekin oso lotuta dago eta neuronaren markatzaile espezifikoetan aberatsa da. M38 metaboloma honetako modulu txikienetako bat da eta neuronen espezifikotasun moderatua ere erakusten du.
Oro har, bost panel hauek zelula mota eta funtzio ugari islatzen dituzte AD kortexean, eta kolektiboki burmuinari lotutako CSF markatzaile dituzte (S2G taula). MS emaitza hauen baliozkotasuna ebaluatzeko, hurbiltasunaren hedapenaren saiakuntza (PEA) erabili dugu, multiplexazio gaitasun, sentikortasun eta espezifikotasun handiko antigorputz ortogonalean oinarritutako teknologia, eta aurkitu ditugun 271 biomarkatzaile hauen azpimultzo bat berriro aztertu ditugu. (n = 36). 36 helburu hauek PEAren AD multiploaren aldaketa erakusten dute, gure MSn oinarritutako aurkikuntzekin oso lotuta dagoena (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), gure MS azterketa integralaren emaitzak sendo egiaztatu dituena (S4 irudia). ).
Gure bost taldeek azpimarratzen dituzten gai biologikoak, seinale sinaptikotik energia-metabolismoraino, AD-ren patogeniarekin lotuta daude (1-3). Hori dela eta, panel hauek dituzten 15 modulu guztiak aurkitu genuen garuneko proteomaren AD patologiarekin lotuta daude (2B irudia). Aipagarriena gure modulu glialen arteko korrelazio patologiko positibo handia eta gure modulu neuronal handienen (M1 eta M3) arteko korrelazio patologiko negatibo handia da. Gure garuneko proteomaren erreplikatutako adierazpen diferentzialak (S3D irudia) M5 eta M18-tik eratorritako proteinak ere nabarmentzen ditu. AsymAD eta AD sintomatikoan, proteina glialak eta M1-ekin erlazionatutako sinapsiak gehien handitu dira Proteina murrizten da gehien. Behaketa hauek adierazten dute bost taldeetan identifikatu ditugun 271 likido zerebroespinalaren markatzaileak AD kortexeko gaixotasun-prozesuekin lotuta daudela, hasierako fase asintomatikoetan gertatzen direnak barne.
Garuneko eta bizkarrezur-likidoaren panel-proteinen aldaketaren norabidea hobeto aztertzeko, gainjarritako 15 modulu bakoitzerako honako hau marraztu genuen: (i) modulu ugaritasun maila aurkitu dugu garuneko datu multzoan eta (ii) modulua. proteina Diferentzia likido zerebroespinalean adierazten da (S5 irudia). Lehen esan bezala, WGCNA garuneko modulu ugaritasuna edo proteina-balioa zehazteko erabiltzen da (13). Sumendien mapa proteina modularren adierazpen diferentziala deskribatzeko erabiltzen da likido zerebroespinalean (AD/kontrola). Zifra hauek erakusten dute bost paneletatik hiruk adierazpen-joera desberdinak erakusten dituztela garunean eta bizkarrezurreko fluidoan. Sinapsi-paneleko bi moduluek (M1 eta M12) AD garuneko ugaritasun mailaren jaitsiera erakusten dute, baina nabarmen gainjartzen dira AD CSFko proteina handituarekin (S5A irudia). Metaboloma duten neuronei lotutako moduluek (M3 eta M38) antzeko garuneko eta likido zerebroespinalaren adierazpen ereduak ez datoz bat (S5E irudia). Panel baskularrak adierazpen-joera desberdinak ere erakutsi zituen, nahiz eta bere moduluak (M6 eta M15) AD garunean neurriz handitu ziren eta gaixotutako LCR-n (S5B irudia). Gainerako bi panelek sare glial handiak dituzte, zeinen proteinak etengabe erregulatuta dauden bi konpartimentuetan (S5, C eta D irudia).
Kontuan izan joera hauek ez direla komunak panel horietako markatzaile guztientzat. Adibidez, panel sinaptikoak AD garunean eta CSFan nabarmen murrizten diren hainbat proteina biltzen ditu (S5A irudia). Beheran araututako likido zefalorakizuloaren markatzaile horien artean, M1eko NPTX2 eta VGF eta M12ko B kromogranina daude. Hala ere, salbuespenak izan arren, gure marka sinaptiko gehienak AD bizkarrezur-likidoan altxatuta daude. Orokorrean, analisi hauek garuneko eta likido zerebroespinalaren maila estatistikoki esanguratsuak bereizteko gai izan ziren gure bost paneletako bakoitzean. Joera hauek ADn garunaren eta CSF proteinaren adierazpenaren arteko erlazio konplexua eta askotan desberdina nabarmentzen da.
Ondoren, MS erreplikazio handiko analisia (CSF erreplikazioa 1) erabili dugu gure 271 biomarkatzaile multzoa helburu itxaropentsu eta erreproduzigarrienetara murrizteko (5A. Irudia). CSF kopiak 1 Emory Goizuetako ADRCko 96 lagin ditu guztira, kontrola, AsymAD eta AD kohortea barne (S1A taula). AD kasu hauek gainbehera kognitibo arina dute (batez besteko MoCA, 20,0 ± 3,8), eta AD biomarkatzaileen aldaketak likido zerebroespinalean baieztatu dira (S1A taula). Aurkitu dugun CSF analisiaren aurka, erreplikazio hau "single-shot" metodo eraginkorragoa eta errendimendu handikoa erabiliz egiten da (off-line zatiketarik gabe), laginak prestatzeko protokolo sinplifikatu bat barne, lagin indibidualen immunoagortzearen beharra ezabatzen duena. . Horren ordez, immunitate-agortutako "hobekuntza-kanal" bakarra erabiltzen da hain ugariak ez diren proteinen seinalea handitzeko (37). Proteomaren guztizko estaldura murrizten badu ere, jaurtiketa bakarreko metodo honek makinaren denbora nabarmen murrizten du eta bideragarri aztertu daitezkeen TMT-etiketatutako lagin kopurua handitzen du (17, 38). Guztira, analisiak 6.487 peptido identifikatu zituen, 96 kasutan 1.183 proteomekin mapatu zituztenak. Aurkitu dugun CSF analisiarekin gertatzen den bezala, laginen gutxienez % 50ean kuantifikatutako proteinak bakarrik sartu ziren ondorengo kalkuluetan, eta datuak atzera egin ziren adinaren eta generoaren ondorioetarako. Honek 792 proteomaren azken kuantifikazioa ekarri zuen, eta horietatik % 95 aurkitutako CSF datu multzoan ere identifikatu ziren.
(A) Garuneko CSF proteina-helburuak erreplikatutako lehen CSF kohortean egiaztatuak eta azken panelean sartuta (n = 60). (Btik E) Paneleko biomarkatzaileen mailak (z-scores konposatuak) CSF lau erreplikazio-kohorteetan neurtuta. T-test parekatuak edo ANOVA Tukey-ren post-zuzenketarekin erabili ziren errepikapen-analisi bakoitzean ugaritasunaren aldaketen esanahi estatistikoa ebaluatzeko. CT, kontrola.
Bereziki interesatzen zaigunez garuneko gure 271 CSF helburuak analisi integralaren bidez egiaztatzea, erreplikatutako proteoma honen azterketa gehiago markatzaile horietara mugatuko dugu. 271 proteina horien artean, 100 detektatu ziren CSF erreplikazioan 1. S6A irudiak gainjarritako 100 markatzaile horien adierazpen diferentziala erakusten du kontrol eta AD erreplikazioaren laginen artean. Sinaptiko eta metabolito histonak gehien hazten dira ADn, eta proteina baskularrak, berriz, gaixotasunetan. Gainjarritako 100 markatzaile gehienek (n = 70) aldaketaren norabide bera mantendu zuten bi datu multzoetan (S6B irudia). Garunarekin erlazionatutako CSF markatzaile baliozkotu hauek (S2H taula) aurrez ikusitako panelen adierazpen joerak islatzen dituzte neurri handi batean, hau da, proteina baskularren beheranzko erregulazioa eta gainerako panel guztien gorako erregulazioa. Balidatutako 70 proteina horietatik 10ek bakarrik erakutsi zuten AD ugaritasunaren aldaketak panelen joera hauen kontraesanean. Garunaren eta likido zerebroespinalaren joera orokorra hobeto islatzen duen panel bat sortzeko, 10 proteina hauek azkenik egiaztatu genuen interes paneletik kanpo utzi genituen (5A irudia). Hori dela eta, gure panelak, azken batean, 60 proteina biltzen ditu guztira CSF AD kohorte independenteetan egiaztatutako laginak prestatzeko eta MS plataformaren analisi desberdinak erabiliz. CSF kopia 1 kontrolean eta AD kasuetan azken panel hauen z-score adierazpen grafikoek aurkitu genuen CSF kohortean ikusitako panelaren joera baieztatu zuten (5B irudia).
60 proteina horien artean, ADrekin erlazionatuta dauden molekulak daude, hala nola osteopontina (SPP1), hau da, ikerketa askotan ADrekin lotu den zitokina proinflamatorioa dena (39-41), eta GAP43, proteina sinaptikoa A. hori argi eta garbi lotuta dago neuroendekapenarekin (42). Gehien egiaztatutako proteinak beste gaixotasun neurodegeneratibo batzuekin lotutako markatzaileak dira, hala nola, alboko esklerosi amiotrofikoarekin (ALS) erlazionatutako superoxido dismutasa 1 (SOD1) eta Parkinson gaixotasunarekin lotutako desakarasa (PARK7). Gainera, egiaztatu dugu beste markatzaile askok, hala nola SMOC1 eta garuneko mintz-atxikimenduaren seinaleztapen proteina 1 (BASP1), aurreko loturak mugatu dituztela neurodegenerazioarekin. Azpimarratzekoa da CSF proteoman duten ugaritasun orokor txikia dela eta, zaila zaigula errendimendu handiko jaurtiketa bakarreko detekzio-metodo hau erabiltzea MAPT eta ADrekin erlazionatutako beste zenbait proteina fidagarri detektatzeko (adibidez, NEFL eta NRGN). ) (43, 44).
Ondoren, lehentasunezko 60 panel-markatzaile hauek hiru erreplika analisi gehigarritan egiaztatu ditugu. CSF Copy 2-n, TMT-MS bakar bat erabili dugu Emory Goizueta ADRCko 297 kontrol eta AD laginen kohorte independente bat aztertzeko (17). CSF erreplikazioak 3-k Lausanneko (45) kontrol eta AD gaixoen TMT-MS datu eskuragarrien berrazterketa bat barne hartu zuen. Datu multzo bakoitzean lehentasunezko 60 markatzaileen bi heren baino gehiago detektatu ditugu. Suitzako ikerketak MS plataforma eta TMT kuantifikazio metodo desberdinak erabili zituen arren (45, 46), gure panelen joerak erreproduzitu genituen bi analisi errepikatuetan (5, C eta D irudia eta S2, I eta J taulak). Gure taldearen gaixotasunaren espezifikotasuna ebaluatzeko, TMT-MS erabili dugu laugarren erreplikazio-datuen multzoa (CSF erreplikazioa 4) aztertzeko, kontrol (n = 18) eta AD (n = 17) kasuak ez ezik, PD ere barne hartzen dituena (n = 17). n = 14)), ALS (n = 18) eta frontotemporal dementzia (FTD) laginak (n = 11) (S1A taula). Kohorte honetan paneleko proteinen ia bi heren arrakastaz kuantifikatu genituen (60tik 38). Emaitza hauek bost biomarkatzaileen paneletan ADren berariazko aldaketak nabarmentzen dituzte (5E irudia eta S2K taula). Metabolitoen taldearen igoerak AD espezifikotasunik indartsuena erakutsi zuen, mielinizazio eta glial taldeek ondoren. Neurri txikiagoan, FTDk ere panel horien artean gorakada bat erakusten du, eta horrek sareko balizko antzeko aldaketak isla ditzake (17). Aitzitik, ALS eta PDk kontrol-taldearen mielinizazio, glial eta metabolomaren profil ia berdinak erakutsi zituzten. Orokorrean, laginak prestatzeko, MS plataformako eta TMT kuantifikazio metodoetan ezberdintasunak izan arren, behin eta berriz analisi hauek erakusten dute gure lehentasunezko paneleko markatzaileek ADren aldaketa oso koherenteak dituztela 500 CSF lagin berezi baino gehiagotan.
AD neurodegenerazioa oso ezaguna izan da sintoma kognitiboak agertu baino urte batzuk lehenago, beraz, premiazkoa da AsymAD-ren biomarkatzaileak (5, 31). Hala ere, gero eta froga gehiagok erakusten dute AsymADren biologia homogeneotik urrun dagoela, eta arriskuaren eta erresilientziaren elkarrekintza konplexuak desberdintasun indibidual handiak eragiten dituela gaixotasunaren ondorengo gaixotasunen progresioan (47). AsymAD kasuak identifikatzeko erabiltzen diren arren, oinarrizko LCR biomarkatzaileen mailak (Aβ1-42, total tau eta p-tau) ez dira frogatu dementziara nork aurrera egingo duen modu fidagarrian iragartzeko gai direnik (4, 7), gehiago adieraziz. beharrezkoa da garunaren fisiologiaren hainbat alderditan oinarritutako biomarkatzaile holistikoko tresnak sartzea populazio honen arriskua zehatz-mehatz estratifikatzeko. Hori dela eta, ondoren, gure AD balioztaturiko biomarkatzaileen panela CSF kopiaren AsymAD populazioan aztertu genuen. 31 AsymAD kasu hauek oinarrizko biomarkatzaileen maila anormalak (Aβ1-42/total tau ELISA ratioa, <5.5) eta kognizio osoa (batez besteko MoCA, 27.1) erakutsi zuten. ± 2,2) (S1A taula). Gainera, AsymAD duten pertsona guztiek 0ko dementzia klinikoko puntuazioa dute, eta horrek adierazten du ez dagoela eguneroko errendimendu kognitibo edo funtzionalaren gainbeheraren frogarik.
Lehenik eta behin, baliozkotutako panelen mailak aztertu ditugu 96 CSF errepliketan 1, AsymAD kohorte barne. AsymAD taldeko hainbat panelek AD antzeko ugaritasun-aldaketa esanguratsuak izan zituztela ikusi genuen, panel baskularrak beheranzko joera erakutsi zuen AsymAD-en, beste panel guztiek goranzko joera zuten bitartean (6A irudia). Hori dela eta, panel guztiek korrelazio oso esanguratsua erakutsi zuten ELISA Aβ1-42 eta guztizko tau mailarekin (6B irudia). Aitzitik, taldearen eta MoCA puntuazioaren arteko korrelazioa nahiko eskasa da. Analisi horien aurkikuntza deigarrienetako bat AsymAD kohortearen panel ugaritasun sorta handia da. 6A irudian ikusten den bezala, AsymAD taldearen panel mailak normalean kontrol taldearen eta AD taldearen panel maila zeharkatzen ditu, aldakortasun nahiko altua erakutsiz. AsymAD-en heterogeneotasun hori gehiago aztertzeko, Multidimensional Scaling (MDS) analisia aplikatu dugu 96 CSF erreplikazio 1 kasuetan. MDS analisiak datu multzoko zenbait aldagairen arabera kasuen arteko antzekotasuna ikusteko aukera ematen du. Kluster-analisi honetarako, CSF aurkikuntza eta erreplikazioaren 1 proteomaren (n = 29) (S2L taula) mailan aldaketa estatistiko esanguratsua duten panel markatzaile balioztatuak (P <0,05, AD/kontrola) bakarrik erabiltzen ditugu. Analisi honek gure kontrol eta AD kasuen arteko multzokatze espazial argia sortu zuen (6C irudia). Aitzitik, AsymAD kasu batzuk argi eta garbi kontrol taldean biltzen dira, eta beste batzuk AD kasuetan kokatzen dira. AsymAD heterogeneotasun hori gehiago aztertzeko, gure MDS mapa erabili dugu AsymAD kasu horien bi talde definitzeko. Lehenengo taldean kontroletik hurbilago bildutako AsymAD kasuak sartu ziren (n = 19), bigarren taldea, berriz, ADtik gertuago dagoen markatzaile profila zuten AsymAD kasuak (n = 12) ezaugarritu zituen.
(A) CSF biomarkatzaile taldearen adierazpen-maila (z-score) CSF erreplikazioaren 1 kohorteko 96 lagin guztietan, AsymAD barne. Tukey-ren ondorengo zuzenketaren bariantza-analisia erabili zen panelen ugaritasunaren aldaketen esanahi estatistikoa ebaluatzeko. (B) Paneleko proteina ugaritasunaren (z-score) korrelazio-analisia MoCA puntuazioarekin eta tau maila osoaren ELISA Aβ1-42 eta CSF kopia 1 laginetan. Pearson-en korrelazio-koefizientea dagokion P balioarekin bistaratzen da. (C) 96 CSF kopia 1 kasuen MDS baliozkotutako 29 panel-markatzaileen ugaritasun-mailetan oinarritzen zen, zeinak nabarmen aldatu ziren aurkikuntzan eta CSF kopiaren 1 datu-multzoetan [P <0.05 AD/kontrol (CT)]. Analisi hau AsymAD taldea kontrol (n = 19) eta AD (n = 12) azpitaldeetan banatzeko erabili zen. (D) Sumendiaren grafikoak CSF erreplikazioko 1 proteina guztien adierazpen diferentziala erakusten du log2 tolestura aldaketarekin (x ardatza) bi AsymAD azpitaldeen arteko -log10 P balio estatistikoarekin. Paneleko biomarkatzaileak koloreztatuta daude. (E) Hautapen-taldeen biomarkatzaileen CSF-ren erreplikazioa 1 ugaritasun-maila desberdin adierazten dira AsymAD azpitaldeen artean. Tukey-ren aldakuntzaren ondorengo doitutako analisia erabili zen esanahi estatistikoa ebaluatzeko.
Kontrol eta AD antzeko AsymAD kasu horien arteko proteina-espresio diferentziala aztertu dugu (6D irudia eta S2L taula). Ondorioz, sumendien mapak erakusten du 14 panel-marka nabarmen aldatu direla bi taldeen artean. Markatzaile horietako gehienak sinapsiaren eta metabolomaren kideak dira. Hala ere, SOD1 eta alanina aberatsa den miristoilatutako proteina kinasa C substratua (MARCKS), hurrenez hurren, mielina eta glial immunitate taldeetako kideak ere talde horretakoak dira (6, D eta E irudia). Panel baskularrak AD antzeko AsymAD taldean nabarmen murriztu ziren bi markatzaile ere lagundu zituen, besteak beste, AE lotzeko proteina 1 (AEBP1) eta C9 osagarriaren familiako kidea. ELISA AB1-42 (P = 0,38) eta p-tau (P = 0,28) kontrol eta AD-antzeko AsymAD azpitaldeen artean ez zegoen alde esanguratsurik, baina tau maila osoaren (P = 0,0031). ) (S7. irudia). AsymAD azpitaldeen arteko aldaketak tau maila osoa baino esanguratsuagoak direla adierazten duten panel-markatzaile batzuk daude (adibidez, YWHAZ, SOD1 eta MDH1) (6E irudia). Orokorrean, emaitza hauek adierazten dute gure balioztaturiko panelak gaixotasun asintomatikoa duten pazienteen azpimota eta arrisku potentziala estratifika dezaketen biomarkatzaileak izan ditzakeela.
Premiazkoa da sisteman oinarritutako biomarkatzaile tresnak hobeto neurtzeko eta bideratzeko ADren atzean dauden hainbat fisiopatologia. Tresna hauek gure AD diagnostiko-esparrua aldatzeaz gain, pazientearen tratamendu-estrategia eraginkorrak eta espezifikoak hartzea sustatuko dute (1, 2). Horretarako, proteomika integral alboragabeko ikuspegia aplikatu dugu AD garunean eta CSF-n, web-oinarritutako CSF biomarkatzaileak identifikatzeko, garunean oinarritutako fisiopatologia sorta zabala islatzen duten. Gure analisiak bost CSF biomarkatzaile-panel sortu zituen, zeinak (i) sinapsiak, odol-hodiak, mielina, disfuntzio immunologikoa eta metabolikoa islatzen dituztenak; (ii) erreproduzigarritasun sendoa frogatu MS plataforma ezberdinetan; (iii) Gaixotasun espezifikoen aldaketa progresiboak erakutsi ADaren hasierako eta amaierako faseetan zehar. Orokorrean, aurkikuntza hauek AD ikerketarako eta aplikazio klinikoetarako biomarkatzaile-tresna anitzak, fidagarriak eta web-bideratuak garatzeko urrats itxaropentsua da.
Gure emaitzek AD garun-sarearen proteomaren antolakuntza oso kontserbatua erakusten dute eta sisteman oinarritutako biomarkatzaileen garapenerako aingura gisa erabiltzea onartzen dute. Gure analisiak erakusten du AD eta AsymAD garunak dituzten bi TMT-MS datu multzo independentek modulartasun handia dutela. Aurkikuntza hauek gure aurreko lana luzatzen dute, 2.000 garun-ehun baino gehiagoren modulu indartsuen kontserbazioa frogatuz kohorte independente anitzetako kohorte frontalean, parietalean eta tenporalean (17). Adostasun-sare honek egungo ikerketetan ikusitako gaixotasunekin lotutako hainbat aldaketa islatzen ditu, besteak beste, glial-aberastutako hantura-moduluen hazkundea eta neurona-aberastutako moduluen gutxitzea. Egungo ikerketak bezala, eskala handiko sare honek ere aldaketa modular garrantzitsuak ditu AsymAD-en, eta hainbat fisiopatologia prekliniko ezberdin erakusten ditu (17).
Hala ere, sistema oso kontserbadorea oinarri duen esparru honetan, heterogeneotasun biologiko xeheagoa dago, batez ere ADaren hasierako faseetan dauden pertsonen artean. Gure biomarkatzaileen panelak AsymAD-en bi azpitalde irudikatzeko gai da, CSF markatzaile anitzen adierazpen diferentzial esanguratsua erakusten dutenak. Gure taldeak bi azpitalde hauen arteko desberdintasun biologikoak nabarmendu ahal izan zituen, ADaren oinarrizko biomarkatzaileen mailan nabariak ez zirenak. Kontrol-taldearekin alderatuta, AsymAD gizabanako hauen Aβ1-42/total tau ratioak anormalki baxuak ziren. Hala ere, tau-maila osoak bakarrik nabarmen desberdinak ziren bi AsymAD azpitaldeen artean, Aβ1-42 eta p-tau-mailak nahiko konparagarriak izaten jarraitzen zuten bitartean. CSF tau altua Aβ1-42 mailak baino sintoma kognitiboen iragarle hobea dela dirudienez (7), susmoa dugu bi AsymAD kohorteek gaixotasunaren progresiorako arrisku desberdinak izan ditzaketela. Gure AsymAD-ren laginaren tamaina mugatua eta luzetarako datuen falta kontuan hartuta, ikerketa gehiago behar dira ondorio hauek ziurtasunez ateratzeko. Hala eta guztiz ere, emaitza hauek adierazten dute sisteman oinarritutako CSF panel batek gaixotasunaren fase asintomatikoetan gizabanakoak modu eraginkorrean estratifikatzeko gure gaitasuna hobetu dezakeela.
Oro har, gure aurkikuntzek funtzio biologiko anitzek ADren patogenian duten zeregina onartzen dute. Hala ere, desregulatutako energia-metabolismoa baliozkotutako bost etiketa-panel guztien gai nabarmena bihurtu zen. Proteina metabolikoak, hala nola, hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa 1 (HPRT1) eta laktato deshidrogenasa A (LDHA), balioztatuen diren biomarkatzaile sinaptikoak dira, AD CSF-ren hazkundea oso erreproduzigarria den sexua dela adierazten dutenak. Gure odol-hodiek eta glial-panelek substantzia oxidatzaileen metabolismoan parte hartzen duten hainbat markatzaile dituzte. Aurkikuntza hauek bat datoz prozesu metabolikoek garun osoan betetzen duten funtsezko eginkizunarekin, neuronen energia-eskaera handia asetzeko ez ezik, astrozitoen eta beste glial-zelulen energia-eskaera handiari erantzuteko ere (17, 48). Gure emaitzek gero eta froga gehiago onartzen dute, redox potentzialaren aldaketak eta energia-bideen eteteak AD-ren patogenian parte hartzen duten hainbat prozesu gakoren arteko lotura nagusia izan daitezkeela, besteak beste, mitokondrialaren nahasteak, glialaren bidezko hantura eta kalte baskularra (49). Horrez gain, likido zerebroespinaleko biomarkatzaile metabolikoek proteina diferentzial aberats ugari dituzte gure kontrol eta AD-antzeko AsymAD azpitaldeen artean, energia eta redox bide horien haustura gaixotasunaren fase preklinikoan garrantzitsua izan daitekeela iradokitzen duena.
Behatu ditugun garuneko eta likido zerebroespinalaren panelen joera ezberdinek ere ondorio biologiko interesgarriak dituzte. Neuronatan aberatsak diren sinapsiek eta metabolomek AD garunean maila gutxitu eta likido zerebroespinalean ugaritasuna erakusten dute. Neuronak sinapsietan energia ekoizten duten mitokondrioetan aberatsak direla kontuan hartuta, beren seinale espezializatu ugarientzako energia emateko (50), bi neurona talde hauen adierazpen-profilen antzekotasuna espero da. Neuronen galerak eta kaltetutako zelulen estrusioak garunaren eta CSF panelen joera hauek azal ditzakete ondorengo gaixotasunetan, baina ezin dituzte azaldu ikusten ditugun panelen aldaketa goiztiarrak (13). Gaixotasun asintomatiko goiztiar batean aurkikuntza hauen azalpen posible bat inausketa sinaptiko anormala da. Sagu ereduetan froga berriek iradokitzen dute mikroglia bidezko fagozitosi sinaptikoa modu anormalean aktibatu daitekeela ADn eta garunean sinapsiaren galera goiztiarra ekar dezakeela (51). Baztertutako material sinaptiko hori CSF-n metatu daiteke, eta horregatik ikusten dugu CSF-ren hazkundea neurona panelean. Immunitate bidezko inausketa sinaptikoa ere partzialki azal dezake gaixotasunaren prozesu osoan garunean eta likido zerebroespinalean ikusten dugun proteina glialen hazkundea. Inausketa sinaptikoaz gain, bide exozitikoaren anomalia orokorrek neurona-markatzaileen garuneko eta CSF adierazpen desberdinak ere sor ditzakete. Zenbait ikerketek erakutsi dute AD garunaren patogenian exosomen edukia aldatu egin dela (52). Zelulaz kanpoko bideak ere parte hartzen du Aβ-ren ugalketan (53, 54). Azpimarratzekoa da jariatze exosomikoaren kentzeak AD antzeko patologia murriztu dezakeela AD sagu transgenikoen ereduetan (55).
Aldi berean, panel baskularreko proteinak AD garunean gorakada moderatua erakutsi zuen, baina CSFan nabarmen murriztu zen. Hemato-entzefaloaren (BBB) disfuntzioak aurkikuntza hauek azal ditzake neurri batean. Mortem ondorengo giza ikerketa independente askok frogatu dute ADn BBBren matxura (56, 57). Azterketa hauek zelula endotelialen geruza hertsiki itxi honen inguruan hainbat jarduera anormal baieztatu zituzten, besteak beste, garuneko kapilar isuria eta odol-transmisioko proteinen metaketa peribaskularra (57). Honek azalpen sinple bat eman dezake garuneko proteina baskular altxatuei buruz, baina ezin du guztiz azaldu proteina horien agortzea likido zerebroespinalean. Aukera bat da nerbio-sistema zentrala molekula hauek modu aktiboan isolatzen ari dela, hantura handitzearen eta estres oxidatiboaren arazoa konpontzeko. Panel honetako CSF proteina larrienetako batzuen murrizketa, batez ere lipoproteinen erregulazioan parte hartzen dutenak, hantura-maila kaltegarrien inhibizioarekin eta oxigeno-espezie erreaktiboen prozesu neurobabesgarriarekin lotuta dago. Hori egia da Paroxonase 1 (PON1), zirkulazioan estres oxidatibo maila murrizteaz arduratzen den lipoproteinak lotzen dituen entzima bat (58, 59). Alfa-1-mikroglobulina/bikunina aitzindaria (AMBP) talde baskularraren beste markatzaile nabarmen beheranzko bat da. Bikunin lipidoen garraiatzailearen aitzindaria da, hantura kentzean eta babes neurologikoan ere parte hartzen duena (60, 61).
Hainbat hipotesi interesgarri izan arren, gaixotasun biokimikoen mekanismoak zuzenean antzemateko ezintasuna aurkikuntzak bultzatutako proteomikaren analisiaren muga ezaguna da. Hori dela eta, ikerketa gehiago behar dira biomarkatzaile-panel horien atzean dauden mekanismoak ziurtasunez definitzeko. MSn oinarritutako analisi klinikoaren garapenera aurrera egiteko, etorkizuneko norabideak eskala handiko biomarkatzaileen egiaztapenerako zuzendutako metodo kuantitatiboen erabilera ere eskatzen du, hala nola, erreakzio selektiboa edo paraleloa kontrolatzeko (62). Duela gutxi erreakzio paraleloen monitorizazioa erabili dugu (63) hemen deskribatutako CSF proteina-aldaketa asko balioztatzeko. Lehentasunezko hainbat panel-helburu zehaztasun handiz kuantifikatzen dira, YWHAZ, ALDOA eta SMOC1 barne, gure sinapsi, metabolismo eta hantura-paneletara mapatzen direnak, hurrenez hurren (63). Datuak eskuratzea independentea (DIA) eta MSn oinarritutako beste estrategia batzuk ere erabilgarriak izan daitezke xede egiaztatzeko. Bud et al. (64) Duela gutxi frogatu da gure CSF aurkikuntzaren datu multzoan identifikatutako AD biomarkatzaileen eta DIA-MS datu multzo independentearen artean, Europako hiru kohorte ezberdinetako ia 200 CSF laginez osatuta dagoena. Azken ikerketa hauek gure panelek MSn oinarritutako detekzio fidagarri bihurtzeko duten potentziala onartzen dute. Antigorputz tradizionalak eta aptameroetan oinarritutako detekzioa ere garrantzitsua da AD biomarkatzaile nagusiak garatzeko. CSF-ren ugaritasun txikia dela eta, zailagoa da biomarkatzaile hauek errendimendu handiko MS metodoak erabiliz detektatzea. NEFL eta NRGN ugaritasun baxuko CSF biomarkatzaileen bi adibide dira, gure analisi integralean panelean mapatzen direnak, baina ezin dira fidagarritasunez detektatu gure MS estrategia bakarra erabiliz. Antigorputz anitzetan oinarritutako bideratze-estrategiek, PEA adibidez, markatzaile horien eraldaketa klinikoa susta dezakete.
Oro har, ikerketa honek sistema ezberdinetan oinarritutako CSF AD biomarkatzaileak identifikatzeko eta egiaztatzeko ikuspegi proteomika paregabea eskaintzen du. Markatzaile-panel hauek AD kohorte gehigarrietan eta MS plataformetan optimizatzea itxaropentsua izan daiteke AD arriskuaren estratifikazioa eta tratamendua aurrera eramateko. Panel horien luzetarako maila denboran zehar ebaluatzen duten azterketak ere funtsezkoak dira zein markatzaileen konbinazioak estratifikatzen duen gaixotasun goiztiarreko arriskua eta gaixotasunaren larritasuna aldatzeko.
CSF-k kopiatutako 3 laginak izan ezik, ikerketa honetan erabilitako CSF lagin guztiak Emory ADRCren edo estuki lotutako ikerketa-erakundeen babespean bildu ziren. Proteomika-azterketa hauetan guztira Emory CSF lagin lau multzo erabili ziren. CSF kohorteak 20 kontrol osasuntsu eta 20 AD gaixoren laginak zituela aurkitu zen. CSF kopiak 32 kontrol osasuntsu, 31 AsymAD banako eta 33 AD banakoren laginak biltzen ditu. CSF kopiak 2 147 kontrol eta 150 AD lagin ditu. Gaixotasun anitzeko CSF erreplikazioaren 4 kohorteak 18 kontrol, 17 AD, 19 ALS, 13 PD eta 11 FTD lagin zituen. Emory Unibertsitateko Erakundeen Berrikuspen Batzordeak onartutako akordioaren arabera, Emory ikerketako parte-hartzaile guztiek baimen informatua lortu zuten. Alzheimerraren Zentroetarako 2014ko Zahartzearen Jardunbide Onenaren Institutu Nazionalaren arabera (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), likido zerebroespinala bildu eta gorde egin zen gerri-zulaketaren bidez. Control eta AsymAD eta AD pazienteek ebaluazio kognitibo estandarizatua jaso zuten Emory Cognitive Neurology Clinic edo Goizuetako ADRCn. Haien likido zerebroespinal laginak INNO-BIA AlzBio3 Luminex-ek probatu zituen ELISA Aβ1-42, total tau eta p-tau analisirako (65). ELISA balioak subjektuen sailkapen diagnostikoa laguntzeko erabiltzen dira, ezarritako AD biomarkatzaileen mozketa-irizpideetan oinarrituta (66, 67). CSF beste diagnostiko batzuetarako (FTD, ALS eta PD) oinarrizko datu demografikoak eta diagnostikoak Emory ADRC edo afiliatutako ikerketa erakundeetatik ere lortzen dira. Emory CSF kasu hauen kasu laburpen metadatuak S1A taulan aurki daitezke. Suitzako CSF replication 3 kohortearen ezaugarriak aurretik argitaratu dira (45).
CSF-k lagina aurkitu zuen. CSF datu-multzoaren aurkikuntzaren sakontasuna areagotzeko, ugaritasun handiko proteinen immunitate-kontsumoa egin zen tripsinizazioa baino lehen. Laburbilduz, 40 banakako CSF laginetatik 130 μl CSF eta High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) bolumen berdin bat (Thermo Fisher Scientific, A89868) jarri ziren gelan. tenperatura Inkubatu). 15 minutuz bira eman ondoren, zentrifugatu lagina 1000 g-tan 2 minutuz. 3K iragazki ultrazentrifugoko gailu bat (Millipore, UFC500396) erabili zen isuri-lagina kontzentratzeko 14.000 g-tan zentrifugatuz 30 minutuz. Diluitu lagin-bolumen guztiak 75 μl-ra fosfato tamponatuko gatzarekin. Proteinaren kontzentrazioa azido bizinkoninikoaren (BCA) metodoaren bidez ebaluatu zen fabrikatzailearen protokoloaren arabera (Thermo Fisher Scientific). 40 lagin guztietatik immunodepleted CSF (60 μl) lisyl endopeptidase (LysC) eta tripsinarekin digeritu zen. Laburbilduz, lagina murriztu eta alkilatu zen 1,2 μl 0,5 M tris-2(-carboxyetil)-fosfinarekin eta 3 μl 0,8 M kloroacetamidarekin 90 °C-tan 10 minutuz, eta, ondoren, 15 minutuz ur-bainu batean sonikatu. Lagina 193 μl 8 M urea tamponarekin [8 M urea eta 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] 6 M ureako azken kontzentraziora diluitu zen. LysC (4,5 μg; Wako) giro-tenperaturan gaueko digestiorako erabiltzen da. Ondoren, lagina 1 M urean diluitu zen 50 mM amonio bikarbonatoarekin (ABC) (68). Gehitu tripsina (Promega) kantitate berdin bat (4,5 μg), eta ondoren inkubatu lagina 12 orduz. Azidotu digeritutako peptido-soluzioa % 1eko azido formikoko (FA) eta % 0,1eko azido trifluoroacetikoko (TFA) (66) azken kontzentraziora (66), eta, ondoren, 50 mg-ko Sep-Pak C18 zutabe batekin (Waters) kendu (25). . Ondoren, peptidoa % 50eko azetonitrilo (ACN) 1 ml-tan eluatu zen. Proteinen kuantifikazioa loteetan estandarizatzeko (25), 40 CSF lagin guztietatik 100 μl alikuota konbinatu ziren lagin misto bat sortzeko, eta ondoren barne estandar global (GIS) (48) bost lagintan banatu zen. Banakako laginak eta estandar konbinatuak abiadura handiko hutsean (Labconco) lehortzen dira.
CSF-k lagina kopiatzen du. Dayon eta lankideek aldez aurretik deskribatu dute CSF kopia 3 laginen immunitate agortzea eta digestioa (45, 46). Gainerako lagin erreplikatuak ez ziren indibidualki immunodepleted. Liseri kendu gabeko lagin hauek tripsinan, lehen azaldu bezala (17). Errepikaturiko analisi bakoitzerako, lagin bakoitzetik ateratako peptidoaren 120 μl alikuota elkartu eta bolumen berdineko alikuotatan banatu ziren, TMT markatutako barne estandar global gisa erabiltzeko (48). Banakako laginak eta estandar konbinatuak abiadura handiko hutsean (Labconco) lehortzen dira. Ugaritasun baxuko CSF proteinaren seinalea hobetzeko, lagin bakoitzetik 125 μl konbinatuz, lagin "hobetua" bat prestatu zen errepikatu analisi bakoitzerako [hau da, ikerketa lagina imitatzen duen lagin biologiko bat, baina eskuragarri dagoen kopurua da. askoz handiagoa (37, 69)] CSF lagin misto batean batu zen (17). Lagin mistoa immunoeskuratu zen High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) 12 ml erabiliz, goian deskribatutako moduan digeritu eta ondorengo TMT etiketatze anitzetan sartu zen.
Argitalpenaren ordua: 2021-eko abuztuaren 27a