Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du. Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea). Bitartean, laguntza etengabea bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe errendatuko dugu.
Termofiloak tenperatura altuetan hazten diren mikroorganismoak dira. Horiek aztertzeak bizitza muturreko baldintzetara nola egokitzen den buruzko informazio baliotsua eman dezake. Hala ere, zaila da ohiko mikroskopio optikoekin tenperatura altuko baldintzak lortzea. Berogailu elektriko erresistentean oinarritutako etxean egindako hainbat irtenbide proposatu dira, baina ez dago irtenbide komertzial soilrik. Artikulu honetan, mikroeskalako laser berotzearen kontzeptua mikroskopioaren ikus-eremuaren gainean sartzen dugu termofiloen ikasketetarako tenperatura altuak eskaintzeko, erabiltzailearen ingurunea leuna mantenduz. Laser intentsitate moderatuan mikroeskalako berokuntza lor daiteke urrezko nanopartikula estalitako substratu bat erabiliz, argi xurgatzaile biobateragarri eta eraginkor gisa. Fluidoen konbekzio mikroeskalaren, zelulen atxikipenaren eta mugimendu termoforetiko zentrifugoaren ondorio posibleak eztabaidatzen dira. Metodoa bi espezietan frogatu da: (i) Geobacillus stearothermophilus, 65 °C inguru ugaltzen den bakterio termofilo aktiboa, mikroeskalan beroketapean ernetzen, hazten eta igeri egiten ikusi duguna; (ii) Thiobacillus sp., arkeo hipertermofilo optimoa. 80°C-tan. Lan honek mikroorganismo termofiloen behaketa erraz eta segururako bidea ematen du mikroskopia tresna moderno eta merkeak erabiliz.
Milaka milioi urtetan zehar, Lurreko bizitzak eboluzionatu egin du gure giza ikuspegitik batzuetan muturrekotzat jotzen diren ingurumen-baldintza zabaletara egokitzeko. Bereziki, termofilo izeneko mikroorganismo termofilo batzuk (bakterioak, arkeoak, onddoak) 45 °C eta 122 °C arteko tenperatura tartean hazten dira. edo eremu bolkanikoak. Haien ikerketek interes handia sortu dute azken hamarkadetan, gutxienez bi arrazoirengatik. Lehenik eta behin, haiengandik ikas dezakegu, adibidez, termofiloak 5, 6, 7, 8 entzimak eta mintzak 9 hain tenperatura altuetan nola egonkorrak diren, edo termofiloek nola jasaten dituzten muturreko erradiazio maila10. Bigarrenik, aplikazio bioteknologiko garrantzitsu askoren oinarri dira1,11,12, hala nola, erregaien ekoizpena13,14,15,16, sintesi kimikoa (dihidro, alkoholak, metanoa, aminoazidoak, etab.)17, biomeatzaritza18 eta biokatalizatzaile termoegonkorrak7,11, 13. Hain zuzen ere, gaur egun ezaguna den polimerasaren kate-erreakzioan (PCR)19, Thermus aquaticus bakterio termofilotik isolatutako entzima bat (Taq polimerasa) dakar, aurkitu zen lehen termofiloetako bat.
Dena den, termofiloen azterketa ez da lan erraza eta ezin da inprobisatu inongo laborategi biologikotan. Bereziki, termofilo biziak ezin dira in vitro behatu edozein argi-mikroskopio estandarrekin, nahiz eta merkatuan eskuragarri dauden berogailu-ganberekin, normalean 40 °C-ko tenperatura baxuetarako baloratzen direnak. 1990eko hamarkadaz geroztik, ikerketa talde gutxi batzuk baino ez dira dedikatu tenperatura altuko mikroskopia (HTM) sistemak ezartzera. 1994an Glukh et al. Berotze/hozte ganbera anaerobikotasuna mantentzeko itxitako kapilar angeluzuzenen tenperatura kontrolatzen duen Peltier zelula baten erabileran oinarrituta sortu zen 20 . Gailua 100 °C-ra arte berotu daiteke 2 °C/s-ko abiaduran, egileek Thermotoga maritima bakterio hipertermofiloaren mugikortasuna aztertzeko aukera emanez21. 1999an Horn et al. Oso antzeko gailu bat garatu da, oraindik ere mikroskopia komertzialerako egokiak diren kapilar berotuak erabiltzean oinarrituta, zelulen zatiketa/konexioa aztertzeko. Inaktibitate erlatibo luze baten ondoren, 2012an berriro hasi zen HTM eraginkorren bilaketa, batez ere Horn et al-ek asmatutako gailu bat erabiltzen zuen Wirth taldearen lan-sorta bati lotuta. Duela hamabost urte, arkeo kopuru handi baten mugikortasuna, hipertermofiloak barne, 100 °C arteko tenperaturan ikertu zen kapilar berotuak erabiliz23,24. Jatorrizko mikroskopioa ere aldatu zuten beroketa azkarragoa lortzeko (zenbait minuturen ordez 35 minutu ezarrita dagoen tenperaturara iristeko) eta 2 cm-tik gorako tenperatura-gradiente lineala lortzeko medioan zehar. Tenperatura-gradientea moldatzeko gailu hau (TGFD) termofilo askoren mugikortasuna aztertzeko erabili izan da tenperatura-gradienteen barruan distantzia biologikoki garrantzitsuak 24, 25 .
Kapilar itxiak berotzea ez da termofilo biziak behatzeko modu bakarra. 2012an, Kuwabara et al. Beroarekiko erresistentea den itsasgarriz zigilatutako Pyrex ganberak (Super X2; Cemedine, Japonia) erabili ziren. Laginak merkatuan eskuragarri dagoen berogailu garden batean jarri ziren (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japonia) 110 °C-ra arte berotzeko gai dena, baina jatorriz bioirudietarako pentsatua ez zen. Egileek bakterio termofilo anaerobioen (Thermosipho globiformans, bikoiztu denbora 24 min) zatiketa eraginkorra ikusi zuten 65 °C-tan. 2020an, Pulshen et al. Metalezko plater komertzialen beroketa eraginkorra (AttofluorTM, Thermofisher) etxean egindako bi berogailu-elementu erabiliz frogatu zen: estalkia eta eszenatoki bat (PCR makinan inspiratutako konfigurazioa). Elkarte honek tenperatura likido uniformea lortzen du eta estalkiaren behealdean lurruntzea eta kondentsazioa saihesten ditu. O-ringa erabiltzeak ingurumenarekin gas-trukea saihesten du. HTM hau, Sulfoscope izenekoa, Sulfolobus acidocaldarius irudikatzeko erabili zen 75°C27an.
Sistema horien guztien muga aitortu bat aire-objektiboen erabilera mugatzea izan zen, edozein olio-murgiltze desegokia hain tenperatura altuetarako eta >1 mm-ko lodierako lagin gardenen bidez irudikatzeko. Sistema horien guztien muga aitortu bat aire-objektiboen erabilera mugatzea izan zen, edozein olio-murgiltze desegokia hain tenperatura altuetarako eta >1 mm-ko lodierako lagin gardenen bidez irudikatzeko. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование возование возование возобе возова ьку любое иммерсионное погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и зари подходило для зрачные образцы толщиной > 1 мм. Sistema hauen guztien gabezia aitortua izan zen aire-objektiboen erabileraren muga, olioa murgiltzea ez zelako egokia hain tenperatura altuetarako eta lagin gardenen bidez > 1 mm-ko lodierako bistaratzeko.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适堘都不适吘濙适吘物镜毫米厚的透明样品成像。 Sistema horien guztien muga aitortu bat airea sartutako ispilua erabiltzearen muga da, edozein olio-murgiltze desegokia baita lagin gardenak >1 mm-ko lodiera hain tenperatura altuetan irudikatzeko. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченние использование использование обоздушных объективов, любое иммерсионное пог Ружение в Масло Непригодно для таких высоких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы толщиной> 1 мм. Sistema hauen guztien eragozpen bat aireko lenteen erabilera mugatua da; olioa murgiltzea ez da egokia hain tenperatura altuetarako eta lagin gardenen bidez > 1 mm-ko lodierako bistaratzeko.Duela gutxi, muga hori Charles-Orzag et al. 28, sistema interesgarriaren inguruan berorik ematen ez duen gailu bat garatu zuena, estalkiaren beiraren barruan baizik, ITOz (indio-eztain oxidoa) egindako erresistentzia baten geruza garden mehe batez estalia. Estalkia 75 °C-ra arte berotu daiteke geruza gardenetik korronte elektrikoa pasatuz. Dena den, egileak objektibora ere berotu behar du lentea, baina 65 °C baino gehiagotan, ez kaltetzeko.
Lan hauek erakusten dute tenperatura altuko mikroskopia optiko eraginkorren garapena ez dela oso onartua izan, sarritan etxeko ekipamendua behar dela eta sarritan bereizmen espazialaren truke lortzen dela, eta hori desabantaila larria da, mikroorganismo termofiloak gutxi batzuk baino handiagoak ez direlako. mikrometroak. Berokuntza-bolumen murriztea da HTMren berezko hiru arazo konpontzeko gakoa: bereizmen espazial eskasa, sistema berotzen denean inertzia termiko handia eta inguruko elementuen beroketa kaltegarria (murgiltze-olioa, lente objektiboa... edo erabiltzailearen eskuak) muturreko tenperaturetan. ).
Artikulu honetan, berogailu erresistentean oinarritzen ez den termofiloen behaketarako HTM bat aurkezten dugu. Horren ordez, mikroskopioaren ikus-eremuaren eremu mugatu batean beroketa lokalizatua lortu dugu argia xurgatzen duen substratu baten laser irradiazioaren bidez. Tenperaturaren banaketa fase kuantitatiboaren mikroskopia (QPM) erabiliz bistaratu zen. Metodo honen eraginkortasuna Geobacillus stearothermophilus, 65 °C inguru ugaltzen den eta bikoizketa denbora laburra duena (20 minutu inguru), eta Sulfolobus shibatae, 80 °C-tan ezin hobeto hazten den hipertermofiloa (arkea) frogatzen dute. ilustratzeko. Erreplikazio-tasa normala eta igeriketa tenperaturaren arabera ikusi ziren. Laser HTM (LA-HTM) hau ez dago estalkiaren lodierak edo helburuaren izaerak (airea edo olioa murgiltzea). Horri esker, merkatuan dagoen bereizmen handiko edozein lente erabil daiteke. Gainera, ez du beroketa motela jasaten inertzia termikoaren ondorioz (milisegundoko eskalan berehalako berokuntza lortzen du) eta komertzialki eskuragarri dauden osagaiak baino ez ditu erabiltzen. Segurtasun-kezka berri bakarrak laser izpi indartsuak (normalean 100 mW-koak) egotearekin erlazionatuta daude gailuaren barruan eta, agian, begietatik, babes-betaurrekoak behar dituztenak.
LA-HTM-ren printzipioa laser bat erabiltzea da lagina lokalean berotzeko mikroskopioaren ikus-eremuan (1a. irudia). Horretarako, laginak argia xurgatzen du. Laser-potentzia zentzuzko bat erabiltzeko (100 mW baino gutxiago), ez genuen euskarri likidoaren argiaren xurgapenean fidatu, baizik eta laginaren xurgapena artifizialki handitu genuen substratua urrezko nanopartikulaz estaliz (1c. irudia). Urrezko nanopartikulak argiarekin berotzeak funtsezko garrantzia du plasmonika termikoaren alorrean, biomedikuntzan, nanokimikan edo eguzki-argiaren bilketan espero diren aplikazioekin29,30,31. Azken urteotan, LA-HTM hau fisikan, kimikan eta biologian plasma termikoaren aplikazioekin lotutako hainbat ikerketetan erabili dugu. Metodo honen zailtasun nagusia azken tenperatura-profila bistaratzea da, tenperatura altua laginaren barruko mikroeskala eskualde batera mugatzen baita. Tenperaturaren mapaketa lau uhin-luzera zeharkako ebakidura-interferometroarekin lor daitekeela frogatu dugu, fase kuantitatiboko mikroskopia metodo sinple, bereizmen handiko eta oso sentikorra den bi dimentsioko difrakzio-sareak (gurutze-sareak ere ezagutzen direnak) erabiltzean oinarrituta. 33,34,35,36. Mikroskopia termikoko teknika honen fidagarritasuna, sare gurutzatuen uhin-frontearen mikroskopian (CGM) oinarritutako, azken hamarkadan argitaratutako dozena bat artikulutan frogatu da37,38,39,40,41,42,43.
Laser beroketa, konformazio eta tenperatura mikroskopio paraleloa instalatzeko eskema. b Laginaren geometria urrezko nanopartikulaz estalitako estalki-lamina bat duen AttofluorTM ganberaz osatutakoa. c Begiratu arretaz lagina (ez eskalan). d-k laser izpiaren profil uniformea adierazten du eta (e) urrezko nanopartikulen lagin-planoan ondorengo tenperatura-banaketa simulatua adierazten du. f (g)-n ageri den ondoriozko tenperatura banaketaren simulazioan erakusten den tenperatura uniformea sortzeko egokia den laser izpi-profil anular bat da. Eskala-barra: 30 µm.
Bereziki, duela gutxi lortu dugu ugaztun-zelulak LA-HTM eta CGM-ekin berotzea eta 37-42 °C arteko zelulen bero-shock-erantzunei jarraipena egin genion, teknika hau zelula bizidun bakarreko irudietarako aplikagarria dela frogatuz. Hala ere, tenperatura altuetan mikroorganismoak aztertzeko LA-HTM aplikatzea ez da anbiguoa, ugaztun-zelulekin alderatuta zuhurtzia handiagoa eskatzen baitu: lehenik, medioaren hondoa hamarnaka gradutan (gradu batzuk baino) berotzeak dakar. tenperatura-gradiente bertikal indartsu batera. fluidoen konbekzioa sor dezake 44, zeinak, substratuari irmoki atxikita ez badago, bakterioen mugimendu eta nahasketa desiragarriak eragin ditzake. Konbekzio hori ezabatu daiteke geruza likidoaren lodiera murriztuz. Horretarako, jarraian aurkezten diren esperimentu guztietan, metalezko edalontzi baten barruan kokatutako 15 µm-ko lodiera duten bi estalki-estalki bakterioen suspentsioak jarri ziren (AttofluorTM, Thermofisher, 1b,c irudia). Printzipioz, konbekzioa saihestu daiteke likidoaren lodiera berogailu-laseraren habearen tamaina baino txikiagoa bada. Bigarrenik, hain geometria mugatuan lan egiteak organismo aerobikoak ito ditzake (ikus S2. irudia). Arazo hau saihestu daiteke oxigenoarekiko (edo ezinbesteko beste edozein gasarekiko) iragazkorra den substratu bat erabiliz, estalgailuaren barruan harrapatuta dauden aire-burbuilak utziz edo goiko estalkiontzian zuloak zulatuz (ikus S1. irudia) 45 . Ikerketa honetan, azken irtenbidea aukeratu dugu (1b eta S1 irudiak). Azkenik, laser bidezko berokuntzak ez du tenperatura banaketa uniformerik ematen. Laser izpiaren intentsitate berdinean ere (1d. irudia), tenperatura-banaketa ez da uniformea, difusio termikoaren ondorioz Gauss-aren banaketaren antza du (1e. irudia). Helburua sistema biologikoak aztertzeko ikus-eremuan tenperatura zehatzak ezartzea denean, profil irregularrak ez dira aproposak eta bakterioen mugimendu termoforetikoa ere ekar dezakete substratura atxikitzen ez badira (ikus S3, S4. irud.)39. Horretarako, argi-moduladore espazial bat (SLM) erabili dugu laser izpi infragorria eraztunaren formaren arabera (1f. irudia) laginaren planoan itxuratzeko, eremu geometriko jakin baten barruan tenperatura banaketa guztiz uniformea lortzeko, difusio termikoa izan arren (1d. irudia) 39, 42, 46. Jarri goiko estalki bat metalezko plater baten gainean (1b. irudia) ertainaren lurrunketa saihesteko eta behatu egun batzuetan gutxienez. Goiko estalki hau itxita ez dagoenez, behar izanez gero, euskarri osagarria erraz gehi daiteke edozein unetan.
LA-HTM-k nola funtzionatzen duen ilustratzeko eta ikerketa termofiloan duen aplikagarritasuna frogatzeko, Geobacillus stearothermophilus bakterio aerobikoak aztertu ditugu, hazkuntza-tenperatura optimoa 60-65 °C ingurukoa dutenak. Bakterioak flageloak eta igeri egiteko gaitasuna ere baditu, jarduera zelular normalaren beste adierazle bat eskaintzen duena.
Laginak (1b. irudia) aurrez inkubatu ziren 60 °C-tan ordubetez eta gero LA-HTM lagin-euskarri batean jarri ziren. Aurre-inkubazio hau aukerakoa da, baina oraindik erabilgarria, bi arrazoirengatik: Lehenik eta behin, laserra pizten denean, zelulak berehala hazten eta zatitzen ditu (ikus M1 filma Material osagarrietan). Aurre-inkubaziorik gabe, bakterioen hazkuntza normalean 40 minutu inguru atzeratzen da laginaren gainean ikusteko eremu berri bat berotzen den bakoitzean. Bigarrenik, 1 orduko aurre-inkubazioak bakterioak estalki-ontzira atxikitzea sustatu zuen, laserra piztean termoforesiaren ondorioz zelulak ikus-eremutik irtetea eragotziz (ikus M2 filma Material osagarrietan). Termoforesia partikula edo molekulen mugimendua da tenperatura-gradiente batean zehar, normalean berotik hotzera, eta bakterioak ez dira salbuespena43,47. Efektu desiragarri hau eremu jakin batean ezabatzen da SLM erabiliz laser izpiari forma emateko eta tenperatura banaketa laua lortzeko.
irudian. 2. irudiak CGM-k neurtutako tenperatura-banaketa erakusten du urrezko nanopartikulaz estalitako beirazko substratu bat laser izpi eraztun batekin irradiatuz (1f. irudia). Laser izpiak estalitako eremu osoan tenperatura banaketa laua ikusi zen. Zona hau 65 °C-tan ezarri zen, hazteko tenperatura optimoa. Eskualde honetatik kanpo, tenperatura-kurba berez jaisten da \(1/r\) (non \(r\) koordenatu erradiala den).
a CGM neurketen Tenperatura-mapa laser izpi anular bat erabiliz urrezko nanopartikulen geruza bat irradiatzeko eremu zirkularrean tenperatura-profil laua lortzeko. b Tenperatura-maparen isoterma (a). Laser izpiaren ingerada puntudun zirkulu gris batez irudikatzen da. Esperimentua bi aldiz errepikatu zen (ikus Material osagarriak, S4 irudia).
Bakterio-zelulen bideragarritasuna hainbat orduz kontrolatu zen LA-HTM erabiliz. irudian. 3. irudiak 3 ordu eta 20 minutuko film batetik ateratako lau irudiren denbora tartea erakusten du (M3 filma, Informazio osagarria). Bakterioak aktiboki ugaltzen zirela ikusi zen laserrak zehaztutako eremu zirkularrean tenperatura optimoa zen, 65°C-ra hurbiltzen zirela. Aitzitik, zelulen hazkundea nabarmen murriztu zen tenperatura 50 °C-tik behera jaitsi zenean 10 s.
G. stearothermophilus bakterioen sakonera optikoko irudiak une desberdinetan laser berotu ondoren hazten diren, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, kanpo 200 Minutu bateko film batetik ateratakoa (Informazio osagarrian emandako M3 filma) dagokion tenperatura-mapan gainjarritako. \(t=0\) denboran pizten da laserra. Intentsitate-irudiari isotermak gehitu zaizkio.
Zelulen hazkundea eta tenperaturarekiko duten mendekotasuna gehiago kuantifikatzeko, hasiera batean isolatutako bakterioen hainbat koloniaren biomasaren hazkundea neurtu genuen Movie M3 ikus-eremuan (4. irudia). S6 irudian agertzen dira mini-colonia formatzeko unitatearen (mCFU) eraketaren hasieran aukeratutako bakterio gurasoak. Masa lehorraren neurketak CGM 48 kamera batekin egin ziren, tenperatura-banaketa mapatzeko erabili zena. CGM-k pisu lehorra eta tenperatura neurtzeko duen gaitasuna LA-HTM-ren indarra da. Espero zen bezala, tenperatura altuak bakterioen hazkuntza azkarragoa eragin zuen (4a. irudia). 4b irudiko erdi-log grafikoan erakusten den moduan, tenperatura guztietan hazkuntza hazkunde esponentziala jarraitzen du, non datuek \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ funtzio esponentziala erabiltzen duten). {{ \mbox{cst}}}\), non \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) - belaunaldi-denbora (edo bikoizketa-denbora), \( g =1/ \tau\) – hazkunde-tasa (denbora-unitateko zatiketa kopurua). irudian. 4c-k dagozkien hazkuntza-tasa eta sorkuntza-denbora erakusten ditu tenperaturaren arabera. Hazkunde azkarreko mCFU-ak bi orduren buruan hazkuntzaren saturazioa du ezaugarri, bakterio-dentsitate handiaren ondorioz espero den portaera (kultura likido klasikoetako fase geldikorraren antzekoa). Forma orokorra \(g\left(T\right)\) (4c. irudia) G. stearothermophilus-en espero den bi faseko kurbari dagokio, 60-65 °C inguruko hazkuntza-tasa optimoarekin. Lotu datuak eredu kardinal bat erabiliz (S5 irudia)49 non \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, literaturan aipatutako beste balio batzuekin ondo bat datorrena49. Tenperaturaren menpeko parametroak errepikagarriak diren arren, \({G}_{0}\)-ren hazkunde-tasa maximoa alda daiteke esperimentu batetik bestera (ikus S7-S9 irudiak eta M4 filma). Tenperatura egokitzeko parametroen aldean, unibertsalak izan beharko liratekeen, hazkunde-tasa maximoa ertainaren propietateen araberakoa da (mantenugaien erabilgarritasuna, oxigeno-kontzentrazioa) behatutako mikroeskalaren geometriaren barruan.
a Mikrobioen hazkuntza hainbat tenperaturatan. mCFU: Miniaturazko Koloniak Osatzeko Unitateak. Tenperatura-gradientean hazten den bakterio bakar baten bideo batetik lortutako datuak (M3 filma). b (a), eskala erdi-logaritmikoa. c Hazkunde-tasa\(\tau\) eta belaunaldi-denbora\(g\) erregresio linealetik (b) kalkulatuta. Errore-barra horizontalak: hazkuntzan mCFU-ak ikus-eremura hedatu ziren tenperatura-tartea. Errore-barra bertikalak: erregresio lineala errore estandarra.
Hazkunde normalaz gain, zenbait bakterio bistaratzen ziren batzuetan laser-berokuntzan, hau da, flageloak dituzten bakterioen portaera espero dena. Informazio gehigarriko M5 filmak igeriketa jarduerak erakusten ditu. Esperimentu honetan, laser erradiazio uniformea erabili zen tenperatura-gradiente bat sortzeko, 1d, e eta S3 irudietan ikusten den bezala. 5. irudiak M5 filmetik hautatutako bi irudi-sekuentzia erakusten ditu, bakterio batek norabide-mugimendua erakusten duela beste bakterio guztiak geldirik geratzen diren bitartean.
Bi denbora-markoek (a) eta (b) zirkulu puntuz markatutako bi bakterio ezberdinen igeriketa erakusten dute. Irudiak M5 filmetik atera ziren (material osagarri gisa ematen da).
G. stearothermophilus-en kasuan, bakterioen mugimendu aktiboa (5. irudia) laser izpia piztu eta segundo gutxira hasi zen. Behaketa honek tenperatura igoerari mikroorganismo termofilo honek duen denborazko erantzuna azpimarratzen du, Mora et al-ek dagoeneko ikusi dutenez. 24 . Bakterioen mugikortasunaren gaia eta baita termotaxiaren gaia gehiago azter daiteke LA-HTM erabiliz.
Mikrobio-igeriketa ez da nahastu behar beste higidura fisiko mota batzuekin, hots (i) higidura browniarra, norabide zehatzik gabeko higidura kaotikoa dirudiena, (ii) 50 konbekzioa eta 43 termoforesiarekin, tenperaturan zehar higiduraren desbideratze erregular batean datza. gradientea.
G. stearothermophilus ezaguna da oso erresistenteak diren esporak (espora eraketa) sortzeko duen gaitasunagatik, defentsa gisa ingurumen-baldintza kaltegarrietan jasaten duenean. Ingurugiro-baldintzak berriz onuragarriak direnean, esporak ernetzen dira, zelula bizidunak sortuz eta hazkuntza berriro hasten da. Esporulazio/ernetze prozesu hau ezaguna den arren, ez da inoiz denbora errealean ikusi. LA-HTM erabiliz, hemen G. stearothermophilus-en ernetze-gertaeren lehen behaketaren berri ematen dugu.
irudian. 6a-k 13 esporako CGM multzo bat erabiliz lortutako sakonera optikoaren (OT) time-lapse irudiak erakusten ditu. Bilketa-denbora osoan (15 h 6 min, \(t=0\) – laser beroketaren hasiera), 13 esporetatik 4 ernatu ziren, ondoz ondoko denbora-puntuetan \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' eta \(11\) h \(30\)'. 6. Irudian gertaera hauetako bakarra erakusten den arren, 4 ernetze-gertaera ikus daitezke M6 filmean material osagarrian. Interesgarria da ernetzea ausazkoa dela dirudi: espora guztiak ez dira ernetzen eta ez dira aldi berean ernetzen, ingurune-baldintzetan aldaketa berdinak izan arren.
a 8 OT irudiz (olio-murgiltze, 60x, 1,25 NA helburua) eta (b) G. stearothermophilus agregatuen biomasaren bilakaeraz osatutako Time-lapsea. c (b) Erdi log eskalan marraztua, hazkunde-tasaren linealtasuna nabarmentzeko (lerro etenarekin).
irudian. 6b,c zelula-populazioen biomasa ikus-eremuan erakusten du denboraren funtzioan datuak biltzeko aldi osoan. Irudian \(t=5\)h-n ikusitako masa lehorraren desintegrazio azkarra. 6b, c, zelula batzuk ikus-eremutik irteteagatik. Lau gertaera hauen hazkunde-tasa \(0,77\pm 0,1\) h-1 da. Balio hori zelulak normal hazten diren 3. 3 eta 4. irudiarekin lotutako hazkunde-tasa baino handiagoa da. Esporetatik G. stearothermophilus-en hazkunde-tasa handitzearen arrazoia ez dago argi, baina neurketa hauek LA-HTM-ren interesa nabarmentzen dute eta zelula bakarreko mailan (edo mCFU bakarrean) lan egiten dute zelulen bizitzaren dinamikari buruz gehiago jakiteko. .
LA-HTM-ren aldakortasuna eta tenperatura altuetan duen errendimendua gehiago frogatzeko, Sulfolobus shibatae-ren hazkuntza aztertu dugu, 80 °C-ko hazkuntza-tenperatura optimoa duen arkea azidofilo hipertermofiloa. G. stearothermophilus-ekin alderatuta, arkeo hauek ere oso morfologia ezberdina dute, mikra 1eko esferen (kokuak) antza duten hagatxo luzangak (baziloak) baino.
7a irudia CGM erabiliz lortutako S. shibatae mCFUren sakonera optikoko irudi sekuentzialak ditu (ikus M7 film luzea Material osagarrietan). mCFU hau 73 °C inguruan hazten da, 80 °C-ko tenperatura optimoaren azpitik, baina hazkuntza aktiborako tenperatura tartean. Fisio-gertaera anitz ikusi genituen, ordu batzuen buruan mCFU-ak arkeoen mikromahatsak diruditenak. OT irudi horietatik, mCFU biomasa denboran zehar neurtu zen eta 7b irudian aurkeztu zen. Interesgarria da S. shibatae mCFU-k G. stearothermophilus mCFU-ekin ikusitako hazkunde esponentziala baino hazkunde lineala erakutsi zuen. Aspaldiko eztabaida izan da 52 zelulen hazkuntza-tasen izaerari buruz: ikerketa batzuek mikrobioen hazkuntza-tasa adierazten duten bitartean, haien tamainarekin proportzionalak diren (hazkunde esponentziala), beste batzuek tasa konstantea erakusten dute (hazkunde lineala edo bilineala). Tzur et al.ek53 azaldu dutenez, hazkunde esponentziala eta (bi)lineala bereizteak biomasaren neurketetan %6ko zehaztasuna eskatzen du, eta hori QPM teknika gehienentzat eskura ez dago, nahiz eta interferometria izan. Tzur et al.ek53 azaldu dutenez, hazkunde esponentziala eta (bi)lineala bereizteak biomasaren neurketetan %6ko zehaztasuna eskatzen du, eta hori QPM teknika gehienentzat eskura ez dago, nahiz eta interferometria izan. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста третом роста третение экспоненциального х биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерфриромерфриромерф. Zur et al.ek53 azaldu dutenez, hazkunde esponentziala eta (bi)lineala bereizteak biomasaren neurketetan %6ko zehaztasuna eskatzen du, eta hori ezin da lortu QPM metodo gehienetan, interferometria erabiliz ere.Zur et al-ek azaldu dutenez. 53, hazkunde esponentziala eta (bi)lineala bereizteak biomasaren neurketetan % 6ko zehaztasuna eskatzen du, eta hori ezin da QPM metodo gehienetarako, interferometria erabiltzen denean ere. CGM-k zehaztasun hori biomasa neurketetan azpi-pg zehaztasunarekin lortzen du36,48.
a 6 OT irudiz (olio-murgilketa, 60x, NA helburua 1.25) eta (b) CGM-rekin neurtutako mikro-CFU biomasaren bilakaeraz osatutako Time-lapsea. Ikus M7 filma informazio gehiago lortzeko.
S. shibatae-ren hazkunde guztiz lineala ustekabekoa izan zen eta oraindik ez da jakinarazi. Hala ere, hazkunde esponentziala espero da, gutxienez denboraren poderioz, 2, 4, 8, 16... zelulen zatiketa anitz gertatu behar delako. Hipotesi genuen hazkunde lineala zelulen paketatze trinkoaren ondorioz zelulen inhibizioaren ondoriozkoa izan zitekeela, zelulen hazkuntza moteldu eta, azkenean, zelulen dentsitatea handiegia denean lozorro-egoerara iristen den bezala.
Bukatzeko honako bost interes puntu hauek eztabaidatzen ditugu txandaka: berokuntza-bolumenaren murrizketa, inertzia termikoaren murrizketa, urre nanopartikulen interesa, fase kuantitatiboen mikroskopioaren interesa eta LA-HTM erabil daitekeen tenperatura-tarte posible bat.
Berokuntza erresistentearekin alderatuta, HTM garapenerako erabiltzen den laser beroketak hainbat abantaila eskaintzen ditu, ikerketa honetan azaltzen ditugunak. Bereziki, mikroskopioaren ikus-eremuko euskarri likidoetan, beroketa-bolumena 3 bolumen gutxiren barruan (10 μm) mantentzen da. Modu honetan, behatutako mikrobioak bakarrik aktiboak dira, eta beste bakterioak lozorroan daude eta lagina gehiago aztertzeko erabil daitezke; ez dago lagina aldatu beharrik tenperatura berri bat egiaztatu behar den bakoitzean. Gainera, mikroeskalan berotzeak tenperatura sorta zabala zuzenean aztertzeko aukera ematen du: 4c irudia 3 orduko pelikula batetik (Movie M3) lortu da, eta horrek normalean hainbat lagin prestatu eta aztertu behar ditu, aztertzen ari diren lagin bakoitzeko bat. y esperimentuko egun kopurua adierazten duen tenperatura da. Berotutako bolumena murrizteak mikroskopioaren inguruko osagai optiko guztiak, batez ere lente objektiboa, giro-tenperaturan mantentzen ditu, komunitateak orain arte izan duen arazo handia izan baita. LA-HTM edozein lenterekin erabil daiteke, olioz murgiltzeko lenteekin barne, eta giro-tenperaturan egongo da ikus-eremuan muturreko tenperaturan egonda ere. Azterketa honetan jakinarazi dugun laser bidezko berokuntza metodoaren muga nagusia itsasten ez diren edo flotatzen ez diren zelulak ikus-eremutik urrun egon daitezkeela eta aztertzeko zailak dira. Konponbidea handitze baxuko lenteak erabiltzea izan liteke ehundaka mikratik gorako tenperatura igoera handiagoa lortzeko. Zuhurtzia honekin bereizmen espaziala gutxitzearekin batera dator, baina helburua mikroorganismoen mugimendua aztertzea bada, ez da bereizmen espazial handia behar.
Sistema berotzeko (eta hozteko) \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) bere tamainaren araberakoa da, legearen arabera \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), non \ (L\ ) bero-iturriaren tamaina bereizgarria da (gure ikerketan laser izpiaren diametroa \(L\ 100\) μm da), \(D\) ingurunearen difusibotasun termikoa (gure batez bestekoa). kasua, beira eta ura Hedapen-abiadura\(D\ 2\{10}^{-7}\) m2/s. Beraz, ikerketa honetan, 50 ms-ko denbora-erantzunak, hau da, ia-istanteak). Tenperatura-aldaketak espero daitezke. Tenperatura igoeraren berehalako ezarpen honek esperimentuaren iraupena laburtzeaz gain, tenperaturaren efektuen edozein azterketa dinamikorako denbora zehatza ahalbidetzen du.
Gure proposatutako metodoa argia xurgatzen duen edozein substratutan aplikagarria da (adibidez, ITO estaldura duten lagin komertzialak). Dena den, urrezko nanopartikulak infragorrian xurgapen handia eta ikusgarriko eremuan xurgapen baxua emateko gai dira, azken ezaugarri horiek interesgarriak direla ikusgarriko eremuan behaketa optiko eraginkorra egiteko, batez ere fluoreszentzia erabiltzean. Horrez gain, urrea biobateragarria da, kimikoki inertea, dentsitate optikoa 530 nm-tik hurbil infragorrira doi daiteke, eta laginak prestatzea erraza eta ekonomikoa da29.
Sarearen zeharkako uhin-frontearen mikroskopiak (CGM) tenperatura-mapaketa mikroeskalan ez ezik, biomasaren monitorizazioa ere ahalbidetzen du, bereziki erabilgarria (beharrezkoa ez bada) LA-HTM-rekin batera. Azken hamarkadan, tenperatura-mikroskopiako beste teknika batzuk garatu dira, batez ere bioirudiaren alorrean, eta gehienek tenperatura-sentikorrak diren zunda fluoreszenteak erabiltzea eskatzen dute54,55. Hala ere, metodo hauek kritikatu egin dira eta zenbait txostenek zelulen barneko tenperatura aldaketa ez-realistak neurtu dituzte, ziurrenik fluoreszentzia tenperatura ez den beste faktore askoren mende dagoelako. Gainera, zunda fluoreszente gehienak ezegonkorrak dira tenperatura altuetan. Hori dela eta, QPM eta bereziki CGM tenperatura mikroskopia-teknika ezin hobea da tenperatura altuko bizitza mikroskopia optikoa erabiliz aztertzeko.
S. shibatae-ren ikerketek, 80 °C-tan ezin hobeto bizi direnek, erakusten dute LA-HTM hipertermofiloak aztertzeko aplika daitekeela, ez termofilo soilak soilik. Printzipioz, ez dago mugarik LA-HTM erabiliz irits daitekeen tenperatura-barrutian, eta 100 °C-tik gorako tenperaturak ere irits daitezke presio atmosferikoan irakiterik gabe, gure 38ko taldeak atmosferako kimika hidrotermalaren aplikazioetan frogatu duenez. presioa A. Laser bat erabiltzen da urrezko nanopartikulak 40 berotzeko modu berean. Beraz, LA-HTM-k aurrekaririk gabeko hipertermofiloak behatzeko ahalmena du bereizmen handiko mikroskopia optiko estandarrarekin baldintza estandarretan (hau da, ingurumeneko estresean).
Esperimentu guztiak etxeko mikroskopio batekin egin ziren, Köhler argiztapena barne (LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), eskuzko xy mugimenduarekin lagin euskarria, helburuak (Olympus, 60x, 0.7 NA, airea, LUCPlanFLN60X edo 60x, 1.25 NA, olioa). , UPLFLN60XOI), CGM kamera (QLSI sare gurutzatua, 39 µm-ko distantzia, Andor Zyla kamera sentsoretik 0,87 mm-ra) intentsitatea eta uhin-frontearen irudiak emateko, eta sCMOS kamera (ORCA Flash 4.0 V3, 16 biteko modua, Hamamatsutik) grabatzeko. 5. irudian agertzen diren datuak (bakterioen igeriketa). Izpi dikroiko-banatzailea 749 nm-ko BrightLine ertza da (Semrock, FF749-SDi01). Kameraren aurrealdeko iragazkia 694 pasa laburreko iragazkia da (FF02-694/SP-25, Semrock). Titaniozko zafiro laserra (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, ponpatutako tsunami laser barrunbea, Spectra-Physics 2-5 irudian, gehiago ordezkatua Millenia laserrak, Spectraphysics 10 W, Mira laser barrunbe ponpatua, Koherentea, 2. irudirako -5). 6 eta 7) \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm-ko uhin-luzeran ezartzen dira, hau da, urrezko nanopartikulen plasmoien erresonantzia-espektroari dagokio.Argi modulatzaile espazialak (1920 × 1152 pixel) Meadowlark Optics-i erosi ziren Hologramak Gerchberg-Saxton algoritmoa erabiliz 39.
Cross grating wavefront microscopy (CGM) mikroskopia optikoko teknika bat da, bi dimentsioko difrakzio sare bat (sare gurutzatua izenez ere ezagutzen dena) kamera konbentzional baten sentsoretik milimetro bateko distantziara konbinatzean oinarrituta. Ikerketa honetan erabili dugun CGM baten adibiderik ohikoena lau uhin-luzerako zeharkako desplazamendu-interferometroa (QLSI) deitzen da, non sare gurutzatua Primot et al-ek aurkeztutako eta patentatutako intentsitate/fasearen xake-taularen eredua baita. 2000. urtean34. Sare-lerro bertikal eta horizontalek sareta-itxurako itzalak sortzen dituzte sentsorean, eta horien distortsioa zenbakizko denbora errealean prozesatu daiteke argi intzidentearen uhin-fronte optikoaren distortsioa (edo fase-profil baliokidea) lortzeko. Mikroskopioan erabiltzen denean, CGM kamera batek irudikatutako objektu baten bide optikoaren diferentzia bistaratu dezake, sakonera optikoa (OT) izenez ere ezaguna, nanometroko sentsibilitatearekin36. CGM edozein neurketetan, osagai optikoen edo izpietan dauden akatsak ezabatzeko, lehen mailako erreferentziazko OT irudi bat hartu eta kendu behar da ondorengo irudietatik.
Tenperaturaren mikroskopia CGM kamera erabiliz egin zen erreferentzian deskribatzen den moduan. 32. Laburbilduz, likido bat berotzeak bere errefrakzio-indizea aldatzen du, izpi intzidentea desitxuratzen duen lente termiko efektu bat sortuz. Uhin-frontearen distortsio hori CGMk neurtzen du eta dekonboluzio-algoritmo baten bidez prozesatzen du, medio likidoan tenperatura-banaketa hiru dimentsio bat lortzeko. Urrezko nanopartikulak lagin osoan zehar uniformeki banatzen badira, tenperatura-mapeoa egin daiteke bakteriorik gabeko eremuetan irudi hobeak sortzeko, batzuetan egiten duguna. Erreferentzia CGM irudia berotu gabe eskuratu zen (laserra itzalita zegoela) eta, ondoren, irudiko leku berean atera zen laserra piztuta zegoela.
Masa lehorra neurtzea tenperatura irudietarako erabiltzen den CGM kamera bera erabiliz lortzen da. CGM erreferentziako irudiak esposizioan zehar x eta y-n lagina azkar mugituz lortu ziren, OT-ko edozein ez-homogeneotasun batez bestekoa bakterioen presentziaren ondorioz. Bakterioen OT irudietatik abiatuta, haien biomasa Matlab-en etxeko segmentazio-algoritmoa erabiliz aukeratutako eremuetan irudi multzo bat erabiliz lortu da (ikus “Zenbakizko kodea”) azpiatala, erref. 48. Laburbilduz, \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} erlazioa erabiltzen dugu } x{{\mbox{d}}}y\), non \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) sakonera optikoko irudia den, \(m\) den pisu lehorra eta \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) konstante bat da. \({{{{\rm{\alpha})))))=0,18\) µm3/pg aukeratu dugu, zelula bizidunen ohiko konstantea dena.
Urrezko nanopartikulaz estalitako 25 mm-ko diametroa eta 150 µm-ko lodiera duen estalkia AttofluorTM ganbera batean (Thermofisher) jarri zen urrezko nanopartikulak gora begira zituela. Geobacillus stearothermophilus gau batez hazi zen LB medioan (200 rpm, 60 °C) esperimentuen egun bakoitzaren aurretik. 0,3 eta 0,5 arteko dentsitate optikoa (OD) duen G. stearothermophilus esekidura baten 5 µl-ko tanta bat jarri zen urrezko nanopartikulak zituen estalki baten gainean. Ondoren, erdian 5 mm-ko diametroko zuloa zuen 18 mm-ko diametroko estalki biribil bat tantara bota zen, eta dentsitate optiko bereko 5 μl bakterio esekidura jarri zen behin eta berriz zuloaren erdian. Estalpien gaineko putzuak erref.n deskribatutako prozeduraren arabera prestatu ziren. 45 (ikus Informazio osagarria informazio gehiago lortzeko). Ondoren, gehitu 1 ml LB medio estalkiari geruza likidoa lehor ez dadin. Azken estalkia Attofluor™ ganberaren estalki itxiaren gainean jartzen da, inkubazioan ertainaren lurrunketa saihesteko. Ernetze-esperimentuak egiteko, esporak erabili genituen, ohiko esperimentuen ondoren, batzuetan goiko estalkia estaltzen zutenak. Sulfolobus shibatae lortzeko antzeko metodo bat erabili zen. Thiobacillus serrata-ren aurretiazko laborantza hiru egun (200 rpm, 75 °C) 182 ertainean (DSMZ) egin ziren.
Urrezko nanopartikulen laginak bloke mizelarren kopolimeroen litografia bidez prestatu ziren. Prozesu hau xeheki deskribatzen da Kap. 60. Laburbilduz, urre ioiak kapsulatzen zituzten mizelak sintetizatu ziren kopolimeroa HAuCl4 toluenoan nahastuz. Ondoren, garbitutako estalkiak disoluzioan murgildu eta UV irradiazioarekin tratatu ziren agente erreduktore baten aurrean, urre-haziak lortzeko. Azkenik, urre-haziak hazi ziren 16 minutuz KAuCl4-ren eta etanolaminaren disoluzio urtsu batekin estalki-zorro batekin kontaktuan jarriz, eta horren ondorioz, urre-nanopartikulen ez-esferikoen antolamendu ia-periodikoa eta oso uniformea lortu zen infragorri hurbilean.
Interferogramak OT irudi bihurtzeko, etxeko algoritmo bat erabili dugu, estekan zehazten den bezala. 33 eta Matlab pakete gisa eskuragarri dago hurrengo biltegi publikoan: https://github.com/baffou/CGMprocess. Paketeak intentsitatea eta OT irudiak kalkula ditzake grabatutako interferogrametan (erreferentziazko irudiak barne) eta kamera-matrizearen distantzietan oinarrituta.
Tenperatura-profil jakin bat lortzeko SLMri aplikatutako fase-eredua kalkulatzeko, aldez aurretik garatutako etxeko algoritmo bat erabili dugu39,42, zeina hurrengo biltegi publikoan dagoena: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Sarrera nahi den tenperatura eremua da, digitalki edo bmp irudi monokromo baten bidez ezar daitekeena.
Zelulak segmentatzeko eta haien pisu lehorra neurtzeko, gure Matlab algoritmoa erabili dugu hurrengo biltegi publikoan argitaratua: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Irudi bakoitzean, erabiltzaileak interesa duen bakterio edo mCFU gainean klik egin behar du, makila-sentsibilitatea egokitu eta hautaketa berretsi.
Ikerketaren diseinuari buruzko informazio gehiago lortzeko, ikusi artikulu honi lotutako Nature Research Report laburpena.
Ikerketa honen emaitzak onartzen dituzten datuak dagozkien egileengandik eskura daitezke, arrazoizko eskaera eginda.
Azterketa honetan erabilitako iturburu-kodea Metodoak atalean zehazten da, eta arazketa-bertsioak https://github.com/baffou/-tik deskargatu daitezke ondorengo biltegietan: SLM_temperatureShaping, CGMprocess eta CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. eta Sharma, AK Termofiloei eta haien espektro zabaleko aplikazioei buruzko ikuspegia. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. eta Sharma, AK Termofiloei eta haien espektro zabaleko aplikazioei buruzko ikuspegia.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. eta Sharma, AK Termofiloen ikuspegi orokorra eta haien aplikazio zabala. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. eta Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. eta Sharma AK Termofiloen ulermen sakona eta aplikazio sorta zabala.3 Bioteknologia 6, 81 (2016).
Argitalpenaren ordua: 2022-09-26